Роль сателлитсвязывающих белков в высокоуровневой организации хроматина

Содержание

Слайд 2

Уровни упаковки генома

Двойная спираль

10 нм фибрилла

30 нм фибрилла

Петельные домены

Фрагмент
конденсированной
хромосомы

Метафазная
хромосома

2 нм 1х

10 нм

Уровни упаковки генома Двойная спираль 10 нм фибрилла 30 нм фибрилла Петельные

30 нм фибрилла 40х

Петельные домены 700х

Интерфаза

?

Из статьи: 
Controlling the double helix
Gary Felsenfeld and Mark Groudine
Nature 421, 448-453

Слайд 3

Хромосомы типа ламповых щеток

Хромосомы типа ламповых щеток

Слайд 4

Доменная гипотеза организации эукариотического генома

Весь геном построен из однотипных блоков - доменов,

Доменная гипотеза организации эукариотического генома Весь геном построен из однотипных блоков -
которые
могут включать один или несколько генов

Домены в целом находятся под контролем особых регуляторных
систем, которые контролируют их транскрипционный статус на уровне
упаковки (более компактной или менее компактной) всего домена в
интерфазной хромосоме

Активный домен

Неактивный домен

Слайд 5

Insulator elements organize the chromatin fiber in the nucleus by establishing separate

Insulator elements organize the chromatin fiber in the nucleus by establishing separate
compartments of higher-order chromatin structure. (A) Domains of open chromatin (yellow nucleosomes) are flanked by insulators (pink, blue and green spheres) that interact together to form a loop. (B) Diagram showing part of a nucleus with compartmentalized chromatin, anchored in part to the nuclear periphery by interactions of the insulators with the nuclear lamina (red lines).

Слайд 6

Experimental approach

Nuclei

DNase I
0,2 M (NH4)2SO4

Nuclear matrix

Extraction

10mM TrisHCl pH=9,
EDTA, Triton X-100, DTT

Q-sepharose
ion exchange
chromatography

SDS-
Gel

Experimental approach Nuclei DNase I 0,2 M (NH4)2SO4 Nuclear matrix Extraction 10mM
mobility shift assay
(GMSA, retardation)

+

GMSA

Polyclonal
Antibodies

Immunoprecipitation
Immunoblotting
Hipershift in GMSA
Immunofluorescence

Affinity
Chromatography

MALDI
(mass spectrometry)

Слайд 7

I. Mus musculus

II. Homo sapiens

Mus

Homo

I. Mus musculus II. Homo sapiens Mus Homo

Слайд 8

Saf-a/hnRNP U

a

b

c

d

Lobov et al., 2000

Saf-a/hnRNP U a b c d Lobov et al., 2000

Слайд 9

- Saf-a IF

- satMa FISH

- DAPI

Lobov et al., 2000

- Saf-a IF - satMa FISH - DAPI Lobov et al., 2000

Слайд 10

- Saf-a

- CENP-B

- DAPI

- Saf-a - CENP-B - DAPI

Слайд 11

Saf-a/hnRNP U domain structure

Saf-a/hnRNP U domain structure

Слайд 12

Saf-a/hnRNP U specifically interacts with
β-actin in the nucleus

Actin and hnRNP U

Saf-a/hnRNP U specifically interacts with β-actin in the nucleus Actin and hnRNP
cooperate for productive transcription by RNA Polymerase II
Kukalev A et al., Nature, 2005

Слайд 15

DNase I
beads

+ nuclear
extract

Saf-a/hnRNP U co-precipitated with b-actin

SDS Page

DNase I beads + nuclear extract Saf-a/hnRNP U co-precipitated with b-actin SDS Page

Слайд 16

Actin binds Saf-a/hnRNP U in vivo

0.5 mM DSP
(dithiobis-
succinimidyl-
propionate)

Nuclear extract
preparation

8M Urea

DNase I
Pull down

Actin binds Saf-a/hnRNP U in vivo 0.5 mM DSP (dithiobis- succinimidyl- propionate)

Слайд 17

Saf-a/GFP fusion proteins

Saf-a FL

1-823 a/a

Saf-a/GFP fusion proteins Saf-a FL 1-823 a/a

Слайд 18

Actin co-localised with fusion Saf-a-GFP in HeLa cells

Saf-a FL/pEGFP-N1

β-Actin/Fibrillarin

Merged

Actin co-localised with fusion Saf-a-GFP in HeLa cells Saf-a FL/pEGFP-N1 β-Actin/Fibrillarin Merged

Слайд 19

Saf-a N1-12/GFP fusion protein

Saf-a N1-12

1-250 a/a - DNA-binding region

Saf-a 21-22/pEGFP-N1

DAPI

Merged

Saf-a N1-12/GFP fusion protein Saf-a N1-12 1-250 a/a - DNA-binding region Saf-a 21-22/pEGFP-N1 DAPI Merged

Слайд 20

Saf-a 21-22/GFP fusion protein

Saf-a 21-22

250-550 a/a - middle part, potential NTP binding

Saf-a 21-22/GFP fusion protein Saf-a 21-22 250-550 a/a - middle part, potential
domain

Saf-a 21-22/pEGFP-N1

DAPI

Merged

Слайд 21

Saf-a 31-N3/GFP fusion protein

Saf-a 31-N3

550-823 a/a - RNA-binding region

Saf-a 31-N3/pEGFP-N1

DAPI

Merged

Saf-a 31-N3/GFP fusion protein Saf-a 31-N3 550-823 a/a - RNA-binding region Saf-a 31-N3/pEGFP-N1 DAPI Merged

Слайд 22

QRTQK motif presents in other nuclear and cytoplasmic proteins

QRTQK motif presents in other nuclear and cytoplasmic proteins

Слайд 23

DNase fingerprinting

GMSA

Southwestern blot

Lobov et al., 2001

Saf-a/hnRNP U DNA binding

DNase fingerprinting GMSA Southwestern blot Lobov et al., 2001 Saf-a/hnRNP U DNA binding

Слайд 24

Computer models of CEN and periCEN DNA fragments

Ulanovsky L.E., Trifonov E.N. 1987
Estimation

Computer models of CEN and periCEN DNA fragments Ulanovsky L.E., Trifonov E.N.
of wedge components in curved DNA
Nature 326:720-726

Слайд 27

c

b

a

Lobov et al., 2001

c b a Lobov et al., 2001

Слайд 28

80 Kb CEN region of NeoCEN10

CEN models

Sullivan et al., 2001

80 Kb CEN region of NeoCEN10 CEN models Sullivan et al., 2001

Слайд 29

Podgornaya et al., 2003

Podgornaya et al., 2003

Слайд 30

Identifying Functional Neighborhoods within the Cell Nucleus: Proximity Analysis of Early S-Phase

Identifying Functional Neighborhoods within the Cell Nucleus: Proximity Analysis of Early S-Phase

Replicating Chromatin Domains to Sites of Transcription, RNA Polymerase II, HP1γ, Matrin 3 and SAF-A
Malyavantham ……Berezney, J Cell Biochem. 2008

Слайд 31

transcription
site

HP1γ
euchromatin

transcription site HP1γ euchromatin

Слайд 32

Multiple
Alignment

Rod-domain like motifs
in TRF2

Voronin et al., 2003

rod domen

TRF2 sp domen

Multiple Alignment Rod-domain like motifs in TRF2 Voronin et al., 2003 rod domen TRF2 sp domen

Слайд 33

ЯМ человека связывает центромерную альфа-сателлитную ДНК

F

mM NaCl

Homo sapiens

LMP

HMP

ЯМ человека связывает центромерную альфа-сателлитную ДНК F mM NaCl Homo sapiens LMP HMP

Слайд 34

Mus musculus

ЯМ мыши связывает ДНК минорного сателлита

NEx

NM

E.coli/MiSat

50

75

75

50

50

150

50

75

75

75

50

50

150

50

75

Mus musculus ЯМ мыши связывает ДНК минорного сателлита NEx NM E.coli/MiSat 50

Слайд 35

Homo sapiens

ЯМ человека связывает прицентромерный сателлит 3

Homo sapiens ЯМ человека связывает прицентромерный сателлит 3

Слайд 36

Аффинная хроматография

Белок 70 кДа ЯМ человека связывает а-сат ДНК

Аффинная хроматография Белок 70 кДа ЯМ человека связывает а-сат ДНК

Слайд 37

Получение АТ

Поликлональные АТ распознают белки массой р80, р70 и р57

Получение АТ Поликлональные АТ распознают белки массой р80, р70 и р57

Слайд 38

Саузвестерн гибридизация

Среди белков, распознаваемых сывороткой именно р70 отвечает за связывание с ДНК

Саузвестерн гибридизация Среди белков, распознаваемых сывороткой именно р70 отвечает за связывание с ДНК

Слайд 39

Выявление IFA детерминанты

Белок р70 обладает общей антигенной детерминантой с белками промежуточных филаментов

а

205

116

97

84

66

55

45

36

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

Выявление IFA детерминанты Белок р70 обладает общей антигенной детерминантой с белками промежуточных

Слайд 40

P70 связывает а-сат ДНК и ДНК сателлита 3

+

NM

HS3

Detection

with AB

:

р70

+

NM

SDS-PAGE

SDS-PAGE

P70 связывает а-сат ДНК и ДНК сателлита 3 + NM HS3 Detection

Слайд 42

Mass-spectrometry analysis: p70=RNA-helicase p68= DEAD/H box polypeptide 5

Mass-spectrometry analysis: p70=RNA-helicase p68= DEAD/H box polypeptide 5

Слайд 43

Распределение р70 в ядре

HeLa MRC5 (сульфат аммония)

Распределение р70 в ядре HeLa MRC5 (сульфат аммония)

Слайд 44

P70 по отношению к а-сат ДНК

MRC5, Upregulated

Single section (0.3μm)

epifluorescent

HeLa

P70 по отношению к а-сат ДНК MRC5, Upregulated Single section (0.3μm) epifluorescent HeLa

Слайд 45

P70 по отношению к сат3

P70 по отношению к сат3

Слайд 46

Определение домена локализации р70

В фибробластах и HeLa р70 находится в SC35 доменах

Определение домена локализации р70 В фибробластах и HeLa р70 находится в SC35
и фибрилах между ними

Слайд 47

P70
Sc35
PML

In MRC5, p70 has been found in PML and SC35 domains

Upregulated

P70 Sc35 PML In MRC5, p70 has been found in PML and SC35 domains Upregulated

Слайд 48

P70
Sc35
PML

In HeLa S (SD), p70 has been found in SC 35 but

P70 Sc35 PML In HeLa S (SD), p70 has been found in
not in PML

HeLa S, grown in serum deprived medium

Слайд 49

Direct Identification of Insulator
Components by Insertional Chromatin
Immunoprecipitation
Toshitsugu Fujita, Hodaka Fujii*
PLoS

Direct Identification of Insulator Components by Insertional Chromatin Immunoprecipitation Toshitsugu Fujita, Hodaka
ONE, 2011

CCCTC-binding factor (CTCF)

Direct Identification of Insulator
Components by Insertional Chromatin
Immunoprecipitation
Toshitsugu Fujita, Hodaka Fujii*
PLoS ONE, 2011

CCCTC-binding factor (CTCF)

Слайд 50

Insulator elements organize the chromatin fiber in the nucleus by establishing separate

Insulator elements organize the chromatin fiber in the nucleus by establishing separate
compartments of higher-order chromatin structure. (A) Domains of open chromatin (yellow nucleosomes) are flanked by insulators (pink, blue and green spheres) that interact together to form a loop. (B) Diagram showing part of a nucleus with compartmentalized chromatin, anchored in part to the nuclear periphery by interactions of the insulators with the nuclear lamina (red lines).

Слайд 51

Взаимодействие хромосом в интерфазе и в митозе

Взаимодействие хромосом в интерфазе и в митозе

Слайд 53

Inter-Chromosomal Contact Networks Provide Insights into Mammalian Chromatin Organization
Stefanie Kaufmann, Christiane

Inter-Chromosomal Contact Networks Provide Insights into Mammalian Chromatin Organization Stefanie Kaufmann, Christiane
Fuchs, Mariya Gonik, Ekaterina E. Khrameeva, Andrey A. Mironov, Dmitrij Frishman

Контакты в области центромера и активного хроматина

Слайд 54

Аггрегация хромосом

Аггрегация хромосом

Слайд 55

Wilson, 1925;
Hsu et al.,1967;
Hoskins, 1968;
Henderson et al.; 1973;
Schneider 1973;

Wilson, 1925; Hsu et al.,1967; Hoskins, 1968; Henderson et al.; 1973; Schneider

Takayama, 1976;
Chiarelli et al. 1977;
Bennet et al., 1983;
Lavany et al., 1984
Radic et al., 1987;
Maniotis et al., 1997;
Nagele et al., 1998;
Dozortsev et al., 2000;
Saifitdinova et al., 2001
Enukashvily et al., 2005
Kuznetsova et al., 2007
Marco et al., 2008

Межхромосомную нить наблюдали:

Слайд 56

Межхромосомная нить

Межхромосомная нить

Слайд 57

Состав нити

600 А
(200 по
другим данным)

20 А

10 А

кинетохор

ДНК-аза –

Состав нити 600 А (200 по другим данным) 20 А 10 А
утрата связи

РНКаза и пепсин –
утрата эластичности

Слайд 58

ДНК (теломерная, интерстициальная, сателлитная)
РНК (рибосомная, мРНК)
Белки, в т.ч. чувствительные к меркаптоэтанолу и

ДНК (теломерная, интерстициальная, сателлитная) РНК (рибосомная, мРНК) Белки, в т.ч. чувствительные к
малорастворимые

Состав нити

Слайд 59

ДНК – FCP повтор зяблика

Saifitdinova et al., 2001

ДНК – FCP повтор зяблика Saifitdinova et al., 2001

Слайд 60

M. Musculus – позднореплицирующаяся ДНК

M. Musculus – позднореплицирующаяся ДНК

Слайд 61

MS4
MS3

MiSat
MaSat

M. Musculus – сатДНК межхромосомной нити

MS4 MS3 MiSat MaSat M. Musculus – сатДНК межхромосомной нити

Слайд 62

P68 в межхромосомной нити

P68 в межхромосомной нити
Имя файла: Роль-сателлитсвязывающих-белков-в-высокоуровневой-организации-хроматина.pptx
Количество просмотров: 44
Количество скачиваний: 0