Роль сателлитсвязывающих белков в высокоуровневой организации хроматина

Уровни упаковки генома
Двойная спираль
10 нм фибрилла
30 нм фибрилла
Петельные домены
Фрагмент
конденсированной
хромосомы
Метафазная
хромосома
2 нм 1х
10 нм 6х
30 нм фибрилла 40х
Петельные домены 700х
Интерфаза
?
Из статьи:
Controlling the double helix
Gary Felsenfeld and Mark Groudine
Nature 421, 448-453

Хромосомы типа ламповых щеток

Доменная гипотеза организации эукариотического генома
Весь геном построен из однотипных блоков - доменов, которые
могут включать один или несколько генов
Домены в целом находятся под контролем особых регуляторных
систем, которые контролируют их транскрипционный статус на уровне
упаковки (более компактной или менее компактной) всего домена в
интерфазной хромосоме
Активный домен
Неактивный домен

Insulator elements organize the chromatin fiber in the nucleus by establishing separate compartments of higher-order chromatin structure. (A) Domains of open chromatin (yellow nucleosomes) are flanked by insulators (pink, blue and green spheres) that interact together to form a loop. (B) Diagram showing part of a nucleus with compartmentalized chromatin, anchored in part to the nuclear periphery by interactions of the insulators with the nuclear lamina (red lines).

Experimental approach
Nuclei
DNase I
0,2 M (NH4)2SO4
Nuclear matrix
Extraction
10mM TrisHCl pH=9,
EDTA, Triton X-100, DTT
Q-sepharose
ion exchange
chromatography
SDS-
Gel mobility shift assay
(GMSA, retardation)
+
GMSA
Polyclonal
Antibodies
Immunoprecipitation
Immunoblotting
Hipershift in GMSA
Immunofluorescence
Affinity
Chromatography
MALDI
(mass spectrometry)

I. Mus musculus
II. Homo sapiens
Mus
Homo

Saf-a/hnRNP U
a
b
c
d
Lobov et al., 2000

- Saf-a IF
- satMa FISH
- DAPI
Lobov et al., 2000

- Saf-a
- CENP-B
- DAPI

Saf-a/hnRNP U domain structure

Saf-a/hnRNP U specifically interacts with
β-actin in the nucleus
Actin and hnRNP U cooperate for productive transcription by RNA Polymerase II
Kukalev A et al., Nature, 2005

DNase I
beads
+ nuclear
extract
Saf-a/hnRNP U co-precipitated with b-actin
SDS Page

Actin binds Saf-a/hnRNP U in vivo
0.5 mM DSP
(dithiobis-
succinimidyl-
propionate)
Nuclear extract
preparation
8M Urea
DNase I
Pull down

Saf-a/GFP fusion proteins
Saf-a FL
1-823 a/a

Actin co-localised with fusion Saf-a-GFP in HeLa cells
Saf-a FL/pEGFP-N1
β-Actin/Fibrillarin
Merged

Saf-a N1-12/GFP fusion protein
Saf-a N1-12
1-250 a/a - DNA-binding region
Saf-a 21-22/pEGFP-N1
DAPI
Merged

Saf-a 21-22/GFP fusion protein
Saf-a 21-22
250-550 a/a - middle part, potential NTP binding domain
Saf-a 21-22/pEGFP-N1
DAPI
Merged

Saf-a 31-N3/GFP fusion protein
Saf-a 31-N3
550-823 a/a - RNA-binding region
Saf-a 31-N3/pEGFP-N1
DAPI
Merged

QRTQK motif presents in other nuclear and cytoplasmic proteins

DNase fingerprinting
GMSA
Southwestern blot
Lobov et al., 2001
Saf-a/hnRNP U DNA binding

Computer models of CEN and periCEN DNA fragments
Ulanovsky L.E., Trifonov E.N. 1987
Estimation of wedge components in curved DNA
Nature 326:720-726

c
b
a
Lobov et al., 2001

80 Kb CEN region of NeoCEN10
CEN models
Sullivan et al., 2001

Podgornaya et al., 2003

Identifying Functional Neighborhoods within the Cell Nucleus: Proximity Analysis of Early S-Phase
Replicating Chromatin Domains to Sites of Transcription, RNA Polymerase II, HP1γ, Matrin 3 and SAF-A
Malyavantham ……Berezney, J Cell Biochem. 2008

transcription
site
HP1γ
euchromatin

Multiple
Alignment
Rod-domain like motifs
in TRF2
Voronin et al., 2003
rod domen
TRF2 sp domen

ЯМ человека связывает центромерную альфа-сателлитную ДНК
F
mM NaCl
Homo sapiens
LMP
HMP

Mus musculus
ЯМ мыши связывает ДНК минорного сателлита
NEx
NM
E.coli/MiSat
50
75
75
50
50
150
50
75
75
75
50
50
150
50
75

Homo sapiens
ЯМ человека связывает прицентромерный
сателлит 3

Аффинная хроматография
Белок 70 кДа ЯМ человека связывает а-сат ДНК

Получение АТ
Поликлональные АТ распознают белки массой р80, р70 и р57

Саузвестерн гибридизация
Среди белков, распознаваемых сывороткой именно р70 отвечает за связывание с ДНК

Выявление IFA детерминанты
Белок р70 обладает общей антигенной детерминантой с белками промежуточных филаментов
а
205
116
97
84
66
55
45
36
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11

P70 связывает а-сат ДНК и ДНК сателлита 3
+
NM
HS3
Detection
with AB
:
р70
+
NM
SDS-PAGE
SDS-PAGE

Mass-spectrometry analysis:
p70=RNA-helicase p68=
DEAD/H box polypeptide 5

Распределение р70 в ядре
HeLa MRC5 (сульфат аммония)

P70 по отношению к
а-сат ДНК
MRC5, Upregulated
Single section (0.3μm)
epifluorescent
HeLa

P70 по отношению к сат3

Определение домена локализации р70
В фибробластах и HeLa р70 находится в SC35 доменах и фибрилах между ними

P70
Sc35
PML
In MRC5, p70 has been found in PML and SC35 domains
Upregulated

P70
Sc35
PML
In HeLa S (SD), p70 has been found in SC 35 but not in PML
HeLa S, grown in serum deprived medium

Direct Identification of Insulator
Components by Insertional Chromatin
Immunoprecipitation
Toshitsugu Fujita, Hodaka Fujii*
PLoS ONE, 2011
CCCTC-binding factor (CTCF)
Direct Identification of Insulator
Components by Insertional Chromatin
Immunoprecipitation
Toshitsugu Fujita, Hodaka Fujii*
PLoS ONE, 2011
CCCTC-binding factor (CTCF)

Insulator elements organize the chromatin fiber in the nucleus by establishing separate compartments of higher-order chromatin structure. (A) Domains of open chromatin (yellow nucleosomes) are flanked by insulators (pink, blue and green spheres) that interact together to form a loop. (B) Diagram showing part of a nucleus with compartmentalized chromatin, anchored in part to the nuclear periphery by interactions of the insulators with the nuclear lamina (red lines).

Взаимодействие хромосом в интерфазе и в митозе

Inter-Chromosomal Contact Networks Provide Insights into Mammalian Chromatin Organization
Stefanie Kaufmann, Christiane Fuchs, Mariya Gonik, Ekaterina E. Khrameeva, Andrey A. Mironov, Dmitrij Frishman
Контакты в области центромера и активного хроматина

Аггрегация хромосом

Wilson, 1925;
Hsu et al.,1967;
Hoskins, 1968;
Henderson et al.; 1973;
Schneider 1973;
Takayama, 1976;
Chiarelli et al. 1977;
Bennet et al., 1983;
Lavany et al., 1984
Radic et al., 1987;
Maniotis et al., 1997;
Nagele et al., 1998;
Dozortsev et al., 2000;
Saifitdinova et al., 2001
Enukashvily et al., 2005
Kuznetsova et al., 2007
Marco et al., 2008
Межхромосомную нить наблюдали:

Межхромосомная нить

Состав нити
600 А
(200 по
другим данным)
20 А
10 А
кинетохор
ДНК-аза – утрата связи
РНКаза и пепсин –
утрата эластичности

ДНК (теломерная, интерстициальная, сателлитная)
РНК (рибосомная, мРНК)
Белки, в т.ч. чувствительные к меркаптоэтанолу и малорастворимые
Состав нити

ДНК – FCP повтор зяблика
Saifitdinova et al., 2001

M. Musculus – позднореплицирующаяся ДНК

MS4
MS3
MiSat
MaSat
M. Musculus – сатДНК межхромосомной нити

P68 в межхромосомной нити