2. ТЗ 4 Вирусы. Бактериофаги

Цель занятия
Изучить особенности строения, жизни, развития вирусов, их строение и классификацию.
Изучить морфологию и строение бактериофагов, значение бактериофагов для лабораторной диагностики, лечения и профилактики инфекционных заболеваний.

План лекции
Краткий очерк развития вирусологии;
Общая характеристика вирусов;
Морфология и структура вирусов;
Классификация вирусов;
Особенности взаимодействия вируса с клеткой хозяина;
Культивирование и индикация вирусов;
Бактериофаги — вирусы бактерий;
Морфология фагов;
Строение бактериофагов
Практическое применение фагов

Вирусология – наука о вирусах
Д.И.Ивановский (1864 – 1920)
В 1892 г. изучая мозаичную болезнь листьев табака, установил, что она вызывается вирусами.

Вирус табачной мозаики

Вирусы – это неклеточная форма существования живой материи.
Для изучения вирусов используют методы:
химические, физические, молекулярно-биологические, иммунобиологические и генетические.

Ультрамикроскопические размеры (нм).
Неклеточное строение.
Содержат только один вид нуклеиновых кислот (или ДНК или РНК).
Не способны самостоятельно синтезировать белок.
Не имеют собственной метаболической системы.
Внутриклеточные молекулярные паразиты.
Не способны к росту и бинарному делению.
Дизъюнктивный способ репродукции.
Тропизм к определенным тканям, органам.
Способность к интеграции генома вируса с геномом клетки.
Вирусы - Царство Virae (лат. virus –яд)

Вирусы, поражающие человека, животных, насекомых, бактерии и растения.
Известно более 600 возбудителей вирусных инфекций у человека:
оспы, бешенства, гриппа, паротита, кори, полиомиелита, клещевого энцефалита, геморрагической лихорадки, ВИЧ и др.

Вирусы:
являются основными возбудителями инфекционных заболеваний человека;
участвуют в процессах канцерогенеза;
могут передаваться различными путями, в т.ч. через плаценту (вирус краснухи, цитомегаловирус и др.);
могут приводить к постинфекционным осложнениям – развитию миокардитов, панкреатитов, иммунодефецитов и др.

Классификация вирусов
по типу нуклеиновой кислоты;
по семействам (Viridae), подсемействам (Virinae), родам (Virus);
по строению внеклеточных форм – вирионов (зрелая вирусная частица);
по морфологии;
типам симметрии;
антигенным свойствам и т.д.

Геном – 6 – 200 генов.
Виды нуклеиновых кислот – двунитевые, однонитевые, негативные, позитивные, смешанной полярности,линейные, кольцевые, фрагментированные
ДНК –вирусы
вирус натуральной оспы,
вирус ветряной оспы,
аденовирусы,
вирус герпеса
РНК - вирусы
вирусы полимиелита,
вирус клещевого энцефалита,
вирусы гриппа,
вирусы парагриппа, паратита, кори.
вирус бешенства

Формы вируса
Вирион
Внеклеточная форма
Вирус
Внутриклеточная форма
Мелкие (15-25 нм)
Полиомиелит,
парвовирусы
Средние (80-120 нм)
Грипп
Крупные (300-400 нм)
Оспа

Морфология вирусов
палочковидные, пулевидные, сферические, овальные, комбинированные.

Морфология вирусов

РНК-содержащие
ДНК-содержащие

Симметрия капсида
Спиральная
Кубическая
(Икосаэдрическая)
Смешанная

Тип симметрии
Спиральный – вирус гриппа, коронавирусы
Икосаэдрический – вирус герпеса

Строение вириона
Геном
ДНК
РНК
Капсомеры
(capsa-коробка)
______
______
______
______
______
______
______
+
-
+
-
_ _ _ _

Строение вирионов
Вирус – нуклеокапсид:
нуклеиновая кислота,
капсид
(белковые субъединицы – капсомеры)

Вирусы
нуклеиновая кислота
белковая оболочка
Простые
Сложные
нуклеиновая кислота
белковая оболочка
липиды
углеводы
компоненты клетки хозяина (суперкапсид).

Строение вириона
Простой: НК+белковая оболочка (капсид) - нуклеокапсид
Сложный: нуклеокапсид+липопротеиновая оболочка - суперкапсид

Сложные вирусы
Суперкапсид (пеплос) – мембранная двойная липопротеиновая оболочка.
Приобретается путем почкования вириона через мембрану клетки (плазматическую, ядра, ЭПР).
Гликопротеиновые шипы – пепломеры.

Строение простых и сложных вирусов

Химический состав вирусов
ДНК или РНК
Белки- из 16-20 аминокислот:
- капсидные
- внутренние
Липиды и углеводы
Ферменты вирусов – нейраминидаза, фосфатаза, лизоцим, гиалуронидаза

Белки вирусов
обладают видовой специфичностью -обусловливают антигенные и иммуногенные свойства вирионов.
Капсид и суперкапсид:
защищают нуклеиновую кислоту от воздействия окружающей среды, нуклеиновую кислоту от деградации;
участвуют в избирательном прикреплении (адсорбции) рецепторными белками к клеткам хозяина;
устойчивы к действию протеолитических ферментов;

Репродукция вирусов
Внутри живой клетки-хозяина.
Нуклеиновые кислоты и белки синтезируются клеткой-хозяином раздельно в разных частях клетки - разобщенная или дизъюнктивная репродукция.

Репродукция вирусов
Адсорбция вируса на поверхности клетки
Проникновение внутрь
«Раздевание» вирионов
Синтез компонентов вириона
Сборка вириона
Выход вириона из клетки

Продуктивное взаимодействие «вирус-клетка» чаще носит литический характер, то есть заканчивается гибелью инфицированной клетки, что происходит после полной сборки дочерней популяции и выхода вирусов из клетки.

Адсорбция вириона на клеточной мембране
прикрепление к клеточной мембране в результате взаимодействия поверхностных прикрепительных белков вируса с мембранными рецепторами клеток хозяина;

В основе тропизма – избирательности поражения вирусами определенных клеток, тканей и органов лежат специфичность рецепторов поражаемой клетки и возможность в ней репродуктивного цикла вируса (пермессивные условия клетки).
Вирусы, репродуцирующиеся в клетках печени – гепатотропные, в нервных клетках – нейротропные, в иммунокомпетентных клетках – иммунотропные.

Способы проникновения вирусов в чувствительные клетки
виропексис (рецепторный эндоцитоз)
слияние вирусной оболочки и клеточной мембраны

Проникновение вирионов в клетку:
Виропексис - проникновение в результате инвагинации участка плазматической мембраны и образования вакуоли с вирусной частицей (в области ямок с белком клатрином).
Слияние мембран - за счет белка слияния суперкапсид вириона интегрирует с клеточной мембраной, а нуклеокапсид попадает в цитоплазму клетки.

Рецепторзависимый эндоцитоз
В результате захватывания и поглощения вириона клеткой - клеточная мембрана с прикрепленным вирионом впячиваются, образуя эндосому (внутриклеточная вакуоль).
Содержимое эндосомы закисляется - ЛПО сложного вируса сливается с мембраной эндосомы – вирусный нуклеокапсид выходит в цитозоль клетки. Эндосомы объединяются с лизосомами, которые разрушают оставшиеся вирусные комипоенты.

Слияние оболочки вириона с клеточной мембраной
Только для некоторых оболочечных вирусов – герпесвирусов, парамиксовирусов, ретровирусов.
У них имеются белки слияния с липидами клеточной мембраны – вирусная ЛПО интегрирует с клеточной мембраной, внутренний компонент вируса попадает в цитозоль клетки.

Проникновение безоболочечных вирусов
мембранный прокол – вирион образует пору в мембране, геном попадает в цитозоль, а капсид остается за пределами;
перфорация – капсид переносится через мембрану без основного лизиса мембраны;
лизис – вирионы индуцируют поломку мембраны ЦПМ органелл – вирус проникает в цитозоль.

Выход из клетки
Простые вирусы
Взрывной путь
Гибель клетки
Сложные вирусы
Почкование (экзоцитоз)

Типы взаимодействия вируса с клеткой
продуктивный тип – активная репродукция новых вирионов с выходом из клетки;
абортивный тип – образование вирионов внезапно прерывается на какой-то стадии;
интегративный (вирогения) – встраивание (интеграция) нуклеиновой кислоты вируса в ДНК клетки-хозяина (клетка приобретает ряд новых свойств - могут возникнуть аутоимунные хронические заболевания, опухоли). Сосуществование вируса и клетки хозяина – вирогения.

Культивирование вирусов
Виды культур клеток
Неперевиваемые клетки (in vitro не размножаются).
Полуперевиваемые клетки (50 генераций).
Перевиваемые (раковые клетки или нормальные клетки зародыша).
Критерии:
Цитопатическое действие (ЦПД)
Включения
Образование бляшек
Гемадсорбция
“Цветная” проба.

Влияние факторов окружающей среды
при действии высоких Т большинство вирусов инактивируется (вирус гепатита – термоустойчив);
к низким Т вирусы не чувствительны;
УФ солнечные лучи инактивируют вирусы;
устойчивы к глицерину;
устойчивы к антибиотикам;
кислоты, щелочи, дезинфицирующие ве-ва инактивируют вирусы

Основные пути передачи вирусов
воздушно-капельный (грипп, оспа);
пищевой (полимиелит, гепатит А),
контактно-бытовой (бешенство),
трансмиссивный (энцефалит).

Выделение вирусов в окружающую среду
со слюной – вирус бешенства,
с отделяемым слизистой носоглотки – вирус гриппа,
с калом – вирус полимиелита и др. энтеровирусы

Рис. 2. Герпесвирус (слева),
вирус гепатита В (справа) (электронная микроскопия)

Рис. 3. Вирус гриппа (слева), вирус иммунодефицита человека (справа) электронная микроскопия

Бактериофаги – вирусы бактерий
1898 г. Н.Ф. Гамалея – лизис сибиреязвенных бацилл,
1915 Ф. Туорт – лизис стафилококков, первый описал.
1917 д’Эрелль – ввел термин «бактериофаг» (phagos – пожирающий).
20-200 нм

Свойства фагов
Способны:
размножаться,
передавать потомству свойства,
изменяться под воздействием различных факторов,
являются паразитами,
обладают строгой специфичностью

Строение фагов
Головка,
Хвостовой отросток (стержень и чехол),
Базальная пластина,
Шипы, фибриллы.
Литические ферменты -
лизоцим,
фосфатаза
гиалуронидаза и др.

Специфичность фагов
Видовая специфичность:
стафилококковый, стрептококковый, холерный, дизентерийный и др.
Моновалентные,
Типовые,
Поливалентные

Взаимодействие бактериофага с бактериальной клеткой - бактериофагия
адсорбция (специфична)
проникновение (инъекция),
репродукция белка и нуклеиновой кислоты,
сборка и формирование зрелых частиц фага,
лизис клетки и выход зрелых частиц («изнутри»).
Лизис «извне» - большое количество фагов адсорбируется на клетке.

Взаимодействие бактериофага с бактериальной клеткой
Адсорбция бактериофага
Внедрение

Взаимодействие бактериофага с бактериальной клеткой
Синтез ДНК и белка
Лизогения
Литический путь
Бактерия
Хромосома
Бактериофаг
ДНК
Формирование

Качественный метод
Зоны лизиса

По характеру действия на микроорганизмы:
вирулентные фаги,
умеренные фаги.
Вирулентные фаги - проникают в клетку, воспроизводятся в ней и вызывают ее лизис с выходом большого количества фагов.
Умеренные фаги - проникают в клетку и встраиваются в хромосому бактерии (профаг), лизис при этом не происходит – симбиоз - лизогения.

Фаговая конверсия - изменение свойств (образование токсинов и др).
Индукция фага - под влиянием УФ лучей и химических веществ профаг может превращаться в вирулентный фаг.

Устойчивость фага
Выдерживают:
нагревание до 750С,
длительное высушивание,
рН 2,0 – 8,0.
нечувствительны к антибиотикам, тимолу, хлороформу и др.
кислоты и дезинфицирующие вещества –губительны.

Применение бактериофагов
Основано на их строгой специфичности
фаготипирования бактерий, т.е. определения фаготипа по лизису штаммов бактерий одного и того же вида типоспецифическими фагами, при эпидемиологическом анализе заболеваний с целью установления их видовой принадлежности;
фагодиагностики, заключающейся в выделении фага из организма больного (например, из испражнений), что косвенно свидетельствует о наличии в материале соответствующих микроорганизмов;
фагопрофилактики - предупреждения некоторых заболеваний (например, дизентерии) среди лиц, находящихся в эпидемическом очаге;
фаготерапии - лечения некоторых инфекционных заболеваний, вызванных, например, шигеллами, протеем, стафилококком.

Применение бактериофагов
Основано на их строгой специфичности
Диагностика заболеваний (фаготипирование) – диагностические препараты.
Лечение и профилактика заболеваний– лечебно- профилактические препараты.
Биотехнология.
Микробиология.

Лечебно-профилактические препараты бактериофагов
1. Для лечения и профилактики кишечных инфекций:
дизентерийный поливалентный,
сальмонеллезный поливалентный групп АВСДЕ,
брюшнотифозный.
2. Для лечения и профилактики гнойно-воспалительных заболеваний:
стафилококковый,
стрептококковый,
синегнойный,
протейный,
клебсиеллезный,
коли-фаг.

Лечебно-профилактические препараты бактериофагов
3. Комбинированные препараты:
коли-протейный,
пиобактериофаг (против стафилококков, стрептококков, клебсиелл, протея, синегнойной и кишечной палочек),
интести–бактериофаг (против шигелл, сальмонелл, стафилококков, энтерококков, кишечной и синегнойной палочек, протея).

Механизм действия препаратов бактериофагов
лизис (гибель) бактерий в очаге воспаления;
стимуляция иммунитета.

Способ применения
препаратов бактериофагов
местно - аппликации на раневую или ожоговую поверхность,
введением в полости (брюшную, плевральную, суставную, мочевой пузырь),
через рот,
ректально.

Лекарственные формы
жидком виде,
таблетках с пектином или кислотоустойчивым покрытием,
мазях,
свечах,
аэрозолях.

Преимущества действия препаратов бактериофагов
специфичность действия (вызывают гибель определенного вида бактерий);
не подавляют нормальную микрофлору организма человека, как антибиотики;
нет противопоказаний и осложнений;
можно использовать в сочетании с другими лекарственными средствами;
активны против бактерий, устойчивых к антибиотикам;
можно использовать для профилактики заболеваний.

Недостатки препаратов бактериофагов
быстро выводятся из организма;
срок годности 12 – 24 мес;
хранятся при температуре +2 - 10°С.

Условия успешного применения бактериофагов:
чувствительность возбудителя к данному бактериофагу;
лечение фагами нужно начинать в первые дни заболевания;
вводить препараты нужно в места локализации возбудителя.

Препараты бактериофагов - высокоэффективное и перспективное средство экстренной терапии гнойно-септических и кишечных инфекций:
отсутствие противопоказаний и осложнений,
возможность использования в сочетании с другими средствами, в том числе антибиотиками,
активность в отношении антибиотикорезистентных штаммов,
адаптация бактериофагов к современным возбудителям.

Вопросы по теме занятия
Дайте определение понятию «фаг».
Укажите, кто впервые наблюдал действие фага; кто открыл фаг и изучил его природу?
Охарактеризуйте природу, химический состав фагов?
Опишите строение фагов.
В чем выражается специфичность действия фага?
Опишите цикл взаимодействия фагов с клетками.
Чем отличается действие вирулентного и умеренного фагов?
Укажите распространение фагов.
Охарактеризуйте отношение фагов к физическим и химическим факторам.
Укажите применение фагов