Биоинженерия. Дезоксирибонуклеиновая кислота

Литература
J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
N.King. RT-PCR protocols. Humana Press.
Д.В.Ребриков и др. ПЦР в реальном времени. Изд-во БИНОМ.
Д.В.Ребриков и др. NGS: высокопроизводительное секвенирование. Изд-во БИНОМ.
http://bitesizebio.com – отличный сайт с объяснением методологии работы с биомакромолекулами

Определение из Википедии:
Биоинженерия (включая инженерию биологических систем) — это применение понятий и методов биологии (и, во вторую очередь, физики (включая инженерию биологических систем) — это применение понятий и методов биологии (и, во вторую очередь, физики, химии (включая инженерию биологических систем) — это применение понятий и методов биологии (и, во вторую очередь, физики, химии, математики (включая инженерию биологических систем) — это применение понятий и методов биологии (и, во вторую очередь, физики, химии, математики и информатики (включая инженерию биологических систем) — это применение понятий и методов биологии (и, во вторую очередь, физики, химии, математики и информатики) для решения актуальных проблем, связанных с науками о живых организмах (включая инженерию биологических систем) — это применение понятий и методов биологии (и, во вторую очередь, физики, химии, математики и информатики) для решения актуальных проблем, связанных с науками о живых организмах или их приложениями, с использованием аналитических (включая инженерию биологических систем) — это применение понятий и методов биологии (и, во вторую очередь, физики, химии, математики и информатики) для решения актуальных проблем, связанных с науками о живых организмах или их приложениями, с использованием аналитических и синтетических (включая инженерию биологических систем) — это применение понятий и методов биологии (и, во вторую очередь, физики, химии, математики и информатики) для решения актуальных проблем, связанных с науками о живых организмах или их приложениями, с использованием аналитических и синтетических методологий инженерного дела, а также его традиционной чувствительности к стоимости и практичности найденных решений.

Определение специального для нашего курса, которое придумал я сам:
Биоинженерия – это практический раздел молекулярной биологии, изучающий способы работы с биологическими макромолекулами и направленного манипулирования ими.
Обратите внимание на слова «молекулярная биология».
Нет молекулярной биологии – нет биоинженерии.

Биоинженерия
Генная инженерия
(работа с генами в пробирке)
Молекулярное клонирование
Белковая инженерия
Геномная инженерия
(работа с геномами в живой клетке)
- Редактирование геномов
Изменение биологических макромолекул и, как следствие свойств живого
Общий методологический арсенал:
электрофорез, рестрикция, лигирование, трансформация, мутагенез, секвенирование, биоинформатика…

Центральная догма молекулярной биологии
(1958 год, Ф.Крик)

На самом деле все оказалось сложнее
В любом случае, отсюда следует, что основным объектом биоинженерии является...

Дезоксирибонуклеиновая кислота!

Принцип комплементарности цепей ДНК

А вот как ДНК выглядит в клетке
Ядро
Хромосома

Ген (др.-греч. γένος — род) — структурная и функциональная единица наследственности живых организмов.
Биоинженерное определение: ген представляет собой участок ДНК, задающий последовательность определённой РНК.
(А почему не белок?)

Первая биоинженерная эпоха: работа с генами
Что научились делать биоинженеры за время первой эпохи?
«вынимать» ДНК из клетки – выделение и очистка нуклеиновых кислот,
видеть ДНК глазами – электрофорез,
«вынимать» нужные участки из ДНК - рестрикция,
соединять несколько участков ДНК в один - лигирование, клонирование,
«засовывать» ДНК в клетку - трансформация,
многократно увеличивать количество нужного участка ДНК - ПЦР,
определять нуклеотидную последовательность нужного участка ДНК - секвенирование,
удалять участки ДНК из геномов,
вставлять в геномы новые участки ДНК,
заставлять один организм экспрессировать гены другого организма.

Выделение и очистка нуклеиновых кислот

Депротеинизация фенолом/хлороформом
ДНК/РНК гидрофильна*. Фенол гидрофобен. Белки содержат гидрофильные и гидрофобные химические группы.

Почему на предыдущем слайде была звездочка?
РНК более кислая, чем ДНК. При кислых рН РНК остается отрицательно заряженной и может гидратироваться, то есть по-прежнему гидрофильна.
ДНК при кислых рН становится нейтральной. Она теряет способность к гидратации и становится гидрофобной.
Метод «кислого фенола» используется для выделения РНК.

Осаждение ДНК/РНК спиртами
(этанол, изопропанол)
Соль (ацетат натрия) добавляется для того, чтобы ионы Na+ нейтрализовали отрицательные заряды фосфатных групп ДНК. Растворимость ДНК снижается. Однако вода обладает высокой диэлектрической константой, что не дает ионам Na+ как следует сблизиться с ДНК, и та остается растворимой.
Спирт обладает значительно более низкой диэлектрической константой. Добавление достаточного количества спирта (около 70% минимум) приводит к усилению электростатического взаимодействия ионов Na+ с ДНК, что вызывает критическое снижение растворимости ДНК и еке выпадение в осадок.
Центрифугирование помогает сконцентрировать всю ДНК из образца в небольшом участке пространства.

Электрофорез
Нуклеиновые кислоты заряжены отрицательно. Если поместить их в гель с соответствующим размером пор и приложить электрическое поле, они начнут перемещаться сквозь поры, причем скорость их перемещения будет прямо пропорциональна заряду, то есть размеру.
Бромистый этидий интеркалирует между цепочками ДНК, возбуждается УФ-светом и испускает в видимом диапазоне (флуоресценция).

Красота-то какая!

Электрофоретическому разделению поддаются фрагменты ДНК самого разного размера