Цепь переноса электронов. Лекция №8

Вопросы с прошлой лекции
E1/E2-механизм β-элиминации при разрыве фосфодиэфирной связи
Секвенирование Illumina

Технология Illumina (Solexa)
https://www.well.ox.ac.uk/ogc/wp-content/uploads/2017/09/Illumina_Sequencing_Overview_15045845_D.pdf

Технология Illumina (Solexa)
https://www.well.ox.ac.uk/ogc/wp-content/uploads/2017/09/Illumina_Sequencing_Overview_15045845_D.pdf

План лекции
Молекулы, попадающие в цепь переноса электронов
Что такое окислительно-восстановительный потенциал
Строение митохондрий
Общая структура цепи переноса электронов
Строение и функционирование каждого из элементов цепи переноса электронов
Железосерные белки

Молекулы, попадающие в цепь переноса электронов
+ 2 NAD+ + 2 АДФ + 2 HPO42-
2
+ 2 NADH + 2 АТФ + 2H+ + 2 H2O
+ NAD+ +
CoA-SCOCH3 + CO2 + NADH
Цитоплазма
Матрикс митохондрий
CoA-SCOCH3 + 3 NAD+ + FAD + ГДФ + HPO42-
CoA-SH + 3 NADH + FADH2 + ГТФ + 2 CO2
Матрикс и внутренняя мембрана митохондрий
не попадают в ЦПЭ

Окислительно-восстановительный потенциал
K=e(-ΔG/RT), где ΔG – изменение свободной энергии (энергии Гиббса); R – универсальная газовая постоянная (8,3 Дж/(моль*К)); T – температура в К
ΔG0 = -ΔE0*n*F, где n – число электронов, переносимых от окислителя к восстановителю; F – постоянная Фарадея (96500 Кл)
1 Дж = 1 Кл*В
ΔE0 = E0ок-ля – E0в-ля, окислитель – молекула, которая забирает электрон (Cu2+); восстановитель – молекула, отдающая электрон (Fe)
Чтобы было ΔG0 < 0, нужно, чтобы ΔE0 > 0
E = E0 + R*T*ln(aOx/aRed)/(nF)
Cu2+ + Fe → Cu + Fe2+

Строение митохондрий
Kühlbrandt, W. Structure and function of mitochondrial membrane protein complexes. BMC Biol 13, 89 (2015). https://doi.org/10.1186/s12915-015-0201-x
Межмембранное пространство
Внешняя мембрана
Кристы
Внутренняя мембрана
Матрикс
Пограничная мембрана
pH межмембранного пространства 7,2 – 7,4; pH матрикса – 7,9 – 8,0
Концентрация белков в матриксе – 500 мг/мл (концентрация РНКазы или лизоцима в пробирке при выделении ДНК 10 мг/мл). Это близко по концентрации белку в кристаллической форме
В мембрану крист встроены комплексы I-V цепи переноса электронов

Комплексы цепи переноса электронов
Kühlbrandt, W. Structure and function of mitochondrial membrane protein complexes. BMC Biol 13, 89 (2015). https://doi.org/10.1186/s12915-015-0201-x
Комплекс I
NADH-дегидрогеназный
Комплекс III
цитохром с редуктазный
Комплекс II
сукцинат дегидрогеназный
Комплекс IV
цитохром с оксидазный
Комплекс V
АТФ-синтазный
матрикс
просвет кристы
pH=7,9-8,0
pH=7,2-7,4

Комплекс I цепи переноса электронов
Zhao RZ, Jiang S, Zhang L and Yu ZB: Mitochondrial electron transport chain, ROS generation and uncoupling (Review). Int J Mol Med 44: 3-15, 2019
Kühlbrandt, W. Structure and function of mitochondrial membrane protein complexes. BMC Biol 13, 89 (2015). https://doi.org/10.1186/s12915-015-0201-x
Комплекс I имеет 2 домена: мембранный и матричный. Всего 14 субъединиц, 45 белков
Комплекс I содержит следующие кофакторы: FMN и 7–9 FeS-кластеров (N3, N1b, N4 и т.д.), которые передают друг другу электроны, которые в конце переходят на убихинон

Комплекс I цепи переноса электронов
Zhao RZ, Jiang S, Zhang L and Yu ZB: Mitochondrial electron transport chain, ROS generation and uncoupling (Review). Int J Mol Med 44: 3-15, 2019
Kühlbrandt, W. Structure and function of mitochondrial membrane protein complexes. BMC Biol 13, 89 (2015). https://doi.org/10.1186/s12915-015-0201-x
FMN сидит на самой верхушке комплекса I
E0 (NAD+/NADH) = - 0,32 В
E0 (FMNH2/flavosemiquinone) = - 0,3 В
E0 (flavosemiquinone/oxidized flavin) = - 0,39 В
E0 (oxidized N3–N6b/reduced N3–N6b) = - 0,25 В
E0 (oxidized N2/reduced N2) = - 0,1 В
E0 (Q/QH2) = 0,11 В
ΔE0 (NADH→FMN)= E0 (FMNH2/flavosemiquinone) - E0 (NAD+/NADH) = 0,3 В – (-0,32 В) = 0,02 В
Чтобы окислительно-восстановительная реакция протекала должно быть ΔE0 > 0

Комплекс I цепи переноса электронов
Zhao RZ, Jiang S, Zhang L and Yu ZB: Mitochondrial electron transport chain, ROS generation and uncoupling (Review). Int J Mol Med 44: 3-15, 2019
Kühlbrandt, W. Structure and function of mitochondrial membrane protein complexes. BMC Biol 13, 89 (2015). https://doi.org/10.1186/s12915-015-0201-x
NAD+
FMN
2Fe-2S кластер (2 Fe3+)
4Fe-4S кластер (3 Fe3+ и 1 Fe2+)
CoQ

Комплекс I цепи переноса электронов
Zhao RZ, Jiang S, Zhang L and Yu ZB: Mitochondrial electron transport chain, ROS generation and uncoupling (Review). Int J Mol Med 44: 3-15, 2019
Kühlbrandt, W. Structure and function of mitochondrial membrane protein complexes. BMC Biol 13, 89 (2015). https://doi.org/10.1186/s12915-015-0201-x
FMN, находящийся на выступе комплекса I, окисляет NADH до NAD+, переходя в состояние FMNH2
FMNH2 передает электроны по цепочке железосерных кластеров, расположенных в порядке увеличения E0: N3→N1b→N4→N5→N6a→N6b→N2
N2 передает электроны на CoQ, при этом N2 меняет свою конформацию и заставляет 4 других субъединицы образовать канал, по которому начинается ток H+ из матрикса в просвет кристы
На 1 пару электронов через мембрану переходит 4 H+

Комплексы цепи переноса электронов
Kühlbrandt, W. Structure and function of mitochondrial membrane protein complexes. BMC Biol 13, 89 (2015). https://doi.org/10.1186/s12915-015-0201-x
Комплекс I
NADH-дегидрогеназный
Комплекс III
цитохром с редуктазный
Комплекс II
сукцинат дегидрогеназный
Комплекс IV
цитохром с оксидазный
Комплекс V
АТФ-синтазный
матрикс
просвет кристы
pH=7,9-8,0
pH=7,2-7,4

Комплекс II цепи переноса электронов
Комплекс II
сукцинат дегидрогеназный
матрикс
просвет кристы
Комплекс I
NADH-дегидрогеназный
Комплекс III
цитохром с редуктазный
Комплекс II представляет собой сукцинат-дегидрогеназу, которая окисляет сукцинат до фумарата в ЦТК
Состоит из 4 субъединиц: 2 гидрофобные (белки CybL и CybS) встроены в мембрану и связываются с CoQ; 2 выпячивают в матрикс и окисляют сукцинат
Электроны от сукцината принимает FAD, который передает их на цепочку из 3-х FeS-белков
С FeS-белков электроны переходят на CoQ
Переноса H+ не происходит
Работает независимо от комплекса I

Комплекс II цепи переноса электронов
FAD
2Fe-2S кластер (2 Fe3+)
4Fe-4S кластер (3 Fe3+ и 1 Fe2+)
CoQ

Комплексы цепи переноса электронов
Kühlbrandt, W. Structure and function of mitochondrial membrane protein complexes. BMC Biol 13, 89 (2015). https://doi.org/10.1186/s12915-015-0201-x
Комплекс I
NADH-дегидрогеназный
Комплекс III
цитохром с редуктазный
Комплекс II
сукцинат дегидрогеназный
Комплекс IV
цитохром с оксидазный
Комплекс V
АТФ-синтазный
матрикс
просвет кристы
pH=7,9-8,0
pH=7,2-7,4

Комплекс III цепи переноса электронов
Комплекс III – это убихинон:цитохром c редуктаза
Представляет собой димер, каждый из мономеров которых состоит из 11 субъединиц
Каталитические субъединицы: цитохром b (bL и bH), цитохром c1, цитохром c и 2Fe-2S-кластер
При передаче электронов осуществляется так-называемый Q-цикл
Суммарно, на 1 пару электронов через мембрану переносится 4 H+
просвет кристы
внешняя и внутренняя мембраны
Cyt bL
матрикс
Cyt bH
2Fe-2S
Cyt c1
Cyt c
QH2
Q
матрикс
Fec(III)

Комплекс III цепи переноса электронов
QH2 связывается с сайтом связывания рядом с цитохромом bL, окисленная форма (Q) – рядом с цитохромом bH
просвет кристы
внешняя и внутренняя мембраны
Cyt bL
матрикс
Cyt bH
2Fe-2S
Cyt c1
Cyt c
QH2
матрикс
Fec(III)
Q

Комплекс III цепи переноса электронов
QH2 связывается с сайтом связывания рядом с цитохромом bL
1 электрон QH2 отдает 2Fe-2S-кластеру, превращаясь в семиубихинон (QH-)
При этом 2 H+ переносится из матрикса в просвет кристы
просвет кристы
внешняя и внутренняя мембраны
Cyt bL
матрикс
Cyt bH
2Fe-2S
Cyt c1
Cyt c
QH-
матрикс
1 e-
2 H+
Fec(III)
Q

Комплекс III цепи переноса электронов
QH2 связывается с сайтом связывания рядом с цитохромом bL
1 электрон QH2 отдает 2Fe-2S-кластеру, превращаясь в семиубихинон (QH-)
При этом 2 H+ переносится из матрикса в просвет кристы
Электрон от 2Fe-2S переходит к цитохрому c1, от него – к цитохрому c (мобильный)
просвет кристы
внешняя и внутренняя мембраны
Cyt bL
матрикс
Cyt bH
2Fe-2S
Cyt c1
Cyt c
QH-
матрикс
2 H+
1 e-
1 e-
Fec(III)
Q

Комплекс III цепи переноса электронов
Образовавшийся QH- более сильный восстановитель, чем QH2 (-0,39 В vs -0,3 В), поэтому он быстро отдает электрон цитохрому bL, а тот – цитохрому bH
В то же время восстановленный цитохром c уходит к комплексу IV, на его место приходит другой окисленный
просвет кристы
внешняя и внутренняя мембраны
Cyt bL
матрикс
Cyt bH
2Fe-2S
Cyt c1
Cyt c
Q
матрикс
к комплексу IV
2 H+
Fec(II)
1 e-
Q
1 e-

Комплекс III цепи переноса электронов
Образовавшийся QH- более сильный восстановитель, чем QH2 (-0,39 В vs -0,3 В), поэтому он быстро отдает электрон цитохрому bL, а тот – цитохрому bH
В то же время восстановленный цитохром c уходит к комплексу IV, на его место приходит другой окисленный
Цитохром bH передает электрон второму окисленному убихинону, в результате чего образуется семиубихинон (QH-)
просвет кристы
внешняя и внутренняя мембраны
Cyt bL
матрикс
Cyt bH
2Fe-2S
Cyt c1
матрикс
2 H+
QH-
Cyt c
Fec(III)
1 e-
Q

Комплекс III цепи переноса электронов
Образовавшийся QH- более сильный восстановитель, чем QH2 (-0,39 В vs -0,3 В), поэтому он быстро отдает электрон цитохрому bL, а тот – цитохрому bH
В то же время восстановленный цитохром c уходит к комплексу IV, на его место приходит другой окисленный
Цитохром bH передает электрон второму окисленному убихинону, в результате чего образуется семиубихинон (QH-)
На место окисленного убихинона к цитохрому bL приходит новая молекула восстановленного QH2
просвет кристы
внешняя и внутренняя мембраны
Cyt bL
матрикс
Cyt bH
2Fe-2S
Cyt c1
матрикс
2 H+
QH-
Cyt c
Fec(III)
QH2

Комплекс III цепи переноса электронов
Новая молекула QH2 передает один электрон на 2Fe-2S. При этом из матрикса в просвет кристы переносится еще 2 H+
Электрон далее передается на цитохром c1 и затем – на цитохром c
просвет кристы
внешняя и внутренняя мембраны
Cyt bL
матрикс
Cyt bH
2Fe-2S
Cyt c1
матрикс
2 H+
QH-
Cyt c
Fec(II)
QH-
1 e-
2 H+
1 e-
1 e-

Комплекс III цепи переноса электронов
Новая молекула QH2 передает один электрон на 2Fe-2S. При этом из матрикса в просвет кристы переносится еще 2 H+
Электрон далее передается на цитохром c1 и затем – на цитохром c
Восстановленный цитохром c уходит, новый окисленный - приходит
Второй электрон через цитохромы bL и bH передается на второй семиубихинон с захватом двух H+, образуя убихинол
просвет кристы
внешняя и внутренняя мембраны
Cyt bL
матрикс
Cyt bH
2Fe-2S
Cyt c1
матрикс
2 H+
QH2
Cyt c
Fec(III)
Q
1 e-
2 H+
1 e-
1 e-

Комплекс III цепи переноса электронов
Итоги:
Два QH2 окислено, один – образовался снова
4 электрона переданы, 2 – на цитохром c
4 H+ перенесены в просвет кристы

Комплексы цепи переноса электронов
Kühlbrandt, W. Structure and function of mitochondrial membrane protein complexes. BMC Biol 13, 89 (2015). https://doi.org/10.1186/s12915-015-0201-x
Комплекс I
NADH-дегидрогеназный
Комплекс III
цитохром с редуктазный
Комплекс II
сукцинат дегидрогеназный
Комплекс IV
цитохром с оксидазный
Комплекс V
АТФ-синтазный
матрикс
просвет кристы
pH=7,9-8,0
pH=7,2-7,4

Комплекс IV цепи переноса электронов
Комплекс IV – это цитохром c оксидаза
Состоит из 13 субъединиц, включая 4 центра с металлами: CuA, гем a (Fea) и один двойной центр (гем a3 и CuB)
Субъединицы I, II и III основные и кодируются в митохондриях, остальные – регулируют активность комплекса IV
Субъединица III участвует в переносе H+
Цитохром c ездит по поверхности мембраны, перенося электроны от комплекса III к комплексу IV
просвет кристы
матрикс
матрикс
Cyt c
Fec(II)
I
II
III
CuA
CuA
Fea
Fea3
CuB

Комплекс IV цепи переноса электронов
Цитохром c передает электроны на центр CuA, с него электроны переходят на гем a, а затем на центр Fea3-CuB, где и происходит восстановление O2 до воды
Всего переносятся почти одновременно 4 электрона с цитохрома c на O2
8 H+ захватываются из матрикса: 4 H+ для образования воды и 4 H+ переносятся в просвет кристы
Таким образом, на пару электронов от цитохрома c переносятся 2 H+
просвет кристы
матрикс
матрикс
4 Cyt c
Fec(II)
I
II
III
CuA
CuA
Fea
Fea3
CuB
4 e-
4 e-
O2 + 4 H+
2 H2O
4 H+

Комплексы цепи переноса электронов
Комплекс I
NADH-дегидрогеназный
Комплекс III
цитохром с редуктазный
Комплекс II
сукцинат дегидрогеназный
Комплекс IV
цитохром с оксидазный
Комплекс V
АТФ-синтазный
матрикс
просвет кристы
pH=7,9-8,0
pH=7,2-7,4
4 H+
4 H+
2 H+

Комплекс V цепи переноса электронов
АТФ-синтазы состоят из двух доменов: F0 (встроен в мембрану) и F1 (выходит в матрикс)
F0 образован кольцом из c-доменов
3 α- и 3 β-субъединицы образуют каталитический центр домена F1
Субъединицы γ, δ и ε формируют стебель, соединяющий F0- и F1-домены
H+, проходя по градиенту через F0, вызывают изменение конформации F1 так, что из АДФ и фосфата образуется АТФ
H+/ATP ≈ 2,9 для митохондрий и 3,9 для хлоропластов *. Это числа почти равно соотношению c и β-субъединиц (3,3 и 4,7)
* Jan Petersen, Kathrin Förster, Paola Turina, and Peter Gräber. Comparison of the H+/ATP ratios of the H+-ATP synthases from yeast and from chloroplast // PNAS July 10, 2012 109 (28) 11150-11155; https://doi.org/10.1073/pnas.1202799109

Расположение комплекса V (АТФ-синтазы) на кристах
Thorsten B. Blum, Alexander Hahn, Thomas Meier, Karen M. Davies, Werner Kühlbrandt. Dimers of mitochondrial ATP synthase induce membrane curvature and self-assemble into rows // Proceedings of the National Academy of Sciences Mar 2019, 116 (10) 4250-4255; DOI: 10.1073/pnas.1816556116
АТФ-синтазы встроены в кристы в виде димеров и расположены целыми рядами
Это необходимо, чтобы H+ не утекали из просвета крист в межмембранное пространство
Так эффективнее идет синтез АТФ
У бактерий этого нет
Такая плотность молекул АТФ-синтазы изгибает мембрану крист

Итоги гликолиза, ПДК, ЦТК и ЦПЭ
+ 2 NAD+ + 2 АДФ + 2 HPO42-
2
+ 2 NADH + 2 АТФ + 2H+ + 2 H2O
+ NAD+ +
CoA-SCOCH3 + CO2 + NADH
Цитоплазма
Матрикс митохондрий
CoA-SCOCH3 + 3 NAD+ + FAD + ГДФ + HPO42-
CoA-SH + 3 NADH + FADH2 + ГТФ + 2 CO2
Матрикс и внутренняя мембрана митохондрий
8 NADH
80 H+
27 АТФ
2 FADH2
12 H+
4 АТФ
Общая сумма: 33 АТФ + 2 ГТФ
x2
x2
не попадают в ЦПЭ
Но это только в идеальной ситуации, на самом деле почти на всех этапах ЦПЭ происходит «подтекание» e- и H+

Ингибиторы цепи переноса электронов
Ротенон: блокирует перенос электронов на комплексе I, используется как инсектицид
Цианид: блокирует комплекс IV, токсичнее, чем ротенон
2,4-DNP (2,4-динитрофенол): делает внутреннюю мембрану митохондрий проницаемой для H+
Олигомицин А: блокирует F0-домен АТФ-синтазы
2,4-DNP
Олигомицин А (R1=CH3, R2, R3, R4=H, R5=CH3)