Как заглянуть в митохондрию с помощью наночастиц

План доклада
Cпектроскопия комбинационного рассеяния
Особенности гигантского комбинационного рассеяния
Типы наноструктур и примеры их применения
Наноструктуры мечты
Наноструктурированные поверхности: получение дальнодействующего усиления на примере изучения митохондрий

Комбинационное рассеяние (КР, или эффект Рамана)
– это неупругое рассеяние света на молекулах вещества с изменением частоты излучения
M.J. Baker et al. (2015) Chem Soc rev
Δν = νвозб. – νКР
Частотный сдвиг, см-1

Спектр КР несет информацию о переходах между колебательными подуровнями, то есть о колебаниях атомов. Следовательно:
Каждому колебанию атомов в молекуле соответствует свой пик на спектре КР
КР уникален для каждой молекулы, т.е. представляет собой «молекулярные отпечатки»
По спектрам КР можно оценить конформационные перестройки в молекулах и изменения микроокружения групп атомов
Li D.-W. et al. (2014). Microchimica Acta
Какую информацию извлекают из спектров КР
Частотный сдвиг, см-1

Okada et al., PNAS, 2012
КР-карта распределения веществ в клетке в псевдо-цвете в норме и при апоптозе: цитохром С, белки, липиды
Возможности КР: картирование клеток label-free

КР позволяет исследовать молекулы даже в целых органах ex vivo
N.А. Brazhe et al., 2013

M, Jermyn et al. 2015
КР позволяет исследовать молекулы даже в целых органах in situ

Brazhe et al. 2018

Основная проблема КР – низкая интенсивность

КР, усиленное наноструктурами металлов
ГКР позволяет получить огромное усиление КР до 14 порядков от молекул, помещенных в непосредственной близости (в т.ч. на поверхности) металлических наноструктур (Ag, Au, Pt, Cu).
Усиления ГКР:
1) Электромагнитное
2) Химическое (при адсорбции молекул)
Гигантское комбинационное рассеяние (ГКР)
Surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS)
TERS SERS

Высокое разрешение (ГКР возникает локально – только на небольшом расстоянии от наночастиц);
Огромное усиление спектров КР от молекул вблизи наноструктур;
Возможность исследовать малейшие концентрации веществ и даже единичные молекулы;
Нет выгорания (в отличие от флуоресценции);
Не требует меток (*)
Преимущества ГКР

Усиление сигнала ГКР от молекул может сильно варьировать во времени в связи с факторами:
Агрегация наночастиц
Изменение конформации молекулы при адсорбции на поверхность наночастицы
Наночастицы могут быть токсичны для клеток
Клетки и физиологические буферы могут «портить» наночастицы
К каждому новому объекту – новый подход…
Трудности
SERS is pain!

Молекулярные сенсоры (с молекулой-репортером)
Наночастицы для усиления сигнала КР от молекул
Работа с низкой концентрацией молекул
Молекулы внутри клеток и органелл!
Распределение молекул? высокое разрешение!
pH- и
глюкозо-
метры
Типы наноструктур
iSERS
(иммуноГКР)
Никельшпарг Э.И. Спектроскопия КР: новые возможности старого метода/ биомолекула.ру

Иммуно-ГКР
Сочетает в себе специфичность иммунохимии и чувствительность ГКР

anti-ICAM-1 (purple), anti-VCAM-1 (red), and anti-P-selectin (blue)
Иммуно-ГКР: трёхцветное ГКР-изображение срезов жировой ткани при внутривенном введении нано-меток
J. Noonan et al., Theranostics, 2018

ГКР рН-метры
Картирование клеток с помощью молекул-репортеров, адсорбированных на наночастицы при эндосомальном введении
Никельшпарг Э.И. Спектроскопия КР: новые возможности старого метода/ биомолекула.ру

ГКР рН-метры
Картирование клеток по кислотности с помощью
4-меркаптобензойной кислоты, адсорбированной на золотые наношарики
J. Kneipp et al / Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine 6 (2010) 214–226

Основное ограничение ГКР – быстрое затухание усиления при удалении молекулы от наноструктуры
В зависимости от наноструктур от r3 до r10
1
2

Основное ограничение ГКР – быстрое затухание усиления при удалении молекулы от наноструктуры
В зависимости от наноструктур от r3 до r10
1
2

Основное ограничение ГКР – быстрое затухание усиления при удалении молекулы от наноструктуры
В месте соприкосновения наноструктур/острых граней/впадин/выпуклостей образуется т.н. «горячая точка» (hot spot) с наибольшим усилением сигнала
1
2

Основное ограничение ГКР – быстрое затухание усиления при удалении молекулы от наноструктуры
1
2
В месте соприкосновения наноструктур/острых граней/впадин/выпуклостей образуется т.н. «горячая точка» (hot spot) с наибольшим усилением сигнала

Можно создать иерархические наноструктуры со множеством горячих точек и дальнодействующим усилением!
1
2

1
2
Можно создать иерархические наноструктуры со множеством горячих точек и дальнодействующим усилением!

А
Semenova et al. (2012, 2016), Brazhe (2015), Sarycheva et al. (2016)
Гладкая поверхность не дает усиления ГКР

Исследование митохондрий
Детекция бактерий
Эритроцитов
Наноструктурированные поверхности
Получение дальнодействующего усиления сигнала за счет плазмонного резонанса.
Меньше требований к токсичности (ничего не проникает в клетку/органеллу)

С

Белковая часть
гем
Цитохромы состоят из белковой части и гема

Nelson, D. L., & Cox, M. M. (2008). Lehninger Principles of Biochemistry.
Гемы различных цитохромов очень похожи:
порфириновое кольцо с железом + боковые радикалы

II
Матрикс
Внутренняя мембрана
Межмембранное
Пространство (ММП)
IV
V
с
Внешняя мембрана
Электрон-транспортная цепь (ЭТЦ)

NAD+
NADH
фумарат
сукцинат
H2O
О2
QH2
QH2
ЭТЦ получает электроны от цикла Кребса через КI (NADH) и КII (сукцинат)
Цикл
Кребса

NAD+
NADH
фумарат
сукцинат
H2O
О2
QH2
QH2
ЭТЦ получает электроны от цикла Кребса через КI (NADH) и КII (сукцинат)
Цикл
Кребса
с
QH2
QH2
2H+
2H+
с

NAD+
NADH
фумарат
сукцинат
H2O
О2
QH2
QH2
Перенос электронов сопровождается переносом протонов, что является движущей силой для синтеза АТФ
Цикл
Кребса
с
QH2
QH2
2H+
2H+
с
ATФ
AДФ+Ф
H+
H+
H+
H+
H+
H+

NAD+
NADH
фумарат
сукцинат
H2O
О2
QH2
QH2
Цитохромы (переносчики электронов) – гемовые белки; обладают интенсивным КР
Цикл
Кребса
с
QH2
QH2
2H+
2H+
с
ATФ
AДФ+Ф
H+
H+
H+
H+
H+
H+
b

Ma et. al., Biochemistry. 1998
Solmaz S.R.N. and Hunte C. J.BiolChem, 2008
Цитохром с
Цитохром с1
Гем С
Конформация
гема
Белок
Ориентация
Перенос электрона

R.V. Chertkova et al., PLoS One, 2017
Скрученная конформация
Sun et al. PNAS, 2014
Чем более скручен гем – тем хуже он переносит электроны

А
Semenova et al. (2012, 2016), Brazhe (2015), Sarycheva et al. (2016)

H2O
О2
QH2
QH2
Дальнодействующее усиление сигнала позволило зарегистрировать спектры ГКР только от
окисленного цитохрома С
с
QH2
QH2
2H+
2H+
с
ATФ
AДФ+Ф
H+
H+
H+
H+
H+
H+
7 нм
10 нм
с
3 нм
Усиление до 15 нм
b

Гем
цитохрома с
Колебания
метиновых
мостиков
Колебания
пиррольных
колец
Колебания боковых
радикалов
Спектр гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) цитохрома С

Спектр гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) митохондрий является спектром окисленного гема цитохрома C

Предложенный подход на основе ГКР
Позволяет регистрировать сигнал от окисленного цитохрома С внутри интактных митохондрий;
Предоставляет уникальную информацию о конформации гема в цитохроме С внутри функционирующей митохондрии, что невозможно получить другими методами;
Чувствителен к функциональному состоянию митохондрий;
Brazhe et al. (2015) Scientific reports

Заключение
Комбинационное рассеяние позволяет детектировать молекулы с большой чувствительностью;
Для каждой молекулы уникальный спектр КР - «Молекулярный отпечаток»;
По спектрам КР можно выявить изменения конформации молекулы;
Гигантское комбинационное рассеяние – это КР, усиленное наноструктурами металлов;
ГКР предоставляет большие возможности для изучения внутриклеточных молекул и значительный диагностический потенциал, но успех во многом зависит от оптимизации наноструктур.