Методы прижизненных исследований

ОБЪЕКТ НАБЛЮДЕНИЯ
жизнь клетки:
фазовый контраст,
DIC
органеллы
GFP
нефлуоресцентное окрашивание
флуоресцентные красители
микрохирургия
процессы

Параметры окружающей среды для линий клеток млекопитающих

Камеры для прижизненных исследований

Перфузионные камеры

Фототоксичность
Контаминация

ОКРАШИВАНИЕ ОРГАНЕЛЛ

Функциональное окрашивание органелл
Митохондрии Родамин123
Аппарат Гольджи Церамид
Лизосомы, эндосомы рН
ЭПР DiOC6(3)

ОКРАШИВАНИЕ МИТОХОНДРИЙ
ПОТЕНЦИАЛ-ЗАВИСИМЫЕ
КРАСИТЕЛИ
ВСЕ МИТОХОНДРИИ
АНТИТЕЛА
Родамин 123
Митотрекеры
JC1
Нанил акридин
оранжевый

Потенциал-зависимые красители.
Прижизненно 10 минут
Не токсичен. При длительном воздействии (более суток) может вызывать гибель трансформированных клеток.
Специфическое окрашивание. Потенциалзависимое окрашивание. Липофильный.
Флуоресцеиновый фильтр – желто-зеленые, тетраметилродаминовый фильтр – красные.
Окрашивает различные типы клеток
Можно использовать в проточной цитофлоуриметрии.
Используется для исследования: апоптоза, внутриклеточного транспорта, метаболической активности, множественной лекарственной устойчивости
Не сохраняется при фиксации
Родамин 123.

Производные родамина 123
Тетраметилрозамин ( флуоресцеиновый фильтр),
Родамин 6G (максимум абсорбции между тетрамелирозамином и родамином 123) ,
Родамин В.
TMRM, TMRE -Эфиры производных родамина – метиловый или этиловый. TMRM, TMRE в низких концентрациях окрашивают митохондрии, в высоких концентрациях окрашивают так же и ЭПР.
TMRE является лучшим, по сравнению с родамином 123 флуоресцентным красителем для исследования динамики и количественных исследований in situ т.к. он быстрее и обратимее накапливается в живой клетке.
TMRM и TMRE используются для измерения митохондриальной деполяризации связанной с выходом Ca2+ и съемок изменения митохондриального потенциала.

Восстановленные производные родаминов и розаминов.
Дигидрородамины
дегидротетраметилрозамины
окисление
флуоресценция
мониторинга промежуточных активных форм кислорода.
Дигидрородамин 123
Пероксидаза
Железо
Цитохром С
перекись водорода
родамин 123.
окисление
1

Хлорометильные производные востановленных розаминов – митотрекеры (MitoTracker Orange CM-H2TMRos,MitoTracker Red CM-H2XRos). Сохраняют окраску после фиксации.
rhod-2 AM
восстановление
Ca2+
Производные родаминов и розаминов.
Ацетоксиметиловый эфир дигидрородамина (acetoxymethyl (AM) ester of dihydrorhod-2)
измерения коллебания уровня Ca2+ в митохондриях
2
3

Окрашивают митохондрии в живых клетках в низких
концентрациях (~20 nM, 0.5 µM or ~0.1 µg/mL);
спектр флуоресцеина
Окрашивают ЭПР при использовании высоких
концентраций
( ~5–50 µM or ~1–10 µg/mL).
ФОТОТОКСИЧЕН
DiOC6(3) используют для демонстрации движения митохондрий вдоль МТ, исследования реорганизация ЭПР при оплодотворении яиц аскариды, для исследования прорастания сосудов в опухоли мышей, МЛУ, визуализация деталей морфологии в нейритах при болезни Альцгеймера Апоптоз
Используется в проточной цитофлоуриметрии DiIC1 и DiOC2 (3) .
DiOC7(3)– окрашивает митохондрий в растительных клетках.
Карбоцианины. DiOC6

DASPMI (4-Di-1-ASP) и DASPEI .
Окраска слабо связана с мембранным потенциалом.
Окрашивание митохондрий в мутантах дрожжей
Долговременной исследование митохондрий в нервных клетках
Исследование метаболизма Pneumocystis carinii
Стериловые красители (Styryl Dyes).

Nonyl Acridine Orange
Окрашивание митохондрий не зависит от мембранного потенциала. Связывается с кардиолипином. Токсичен в высоких концентрациях. Используется в проточной цитофлуориметрии.
Нонил акридиновый оранжевый остается в митохондриях HeLa до 10 дней – удобно исследовать слияние клеток .
Carboxy SNARF-1 pH Indicator
Исследование внутримитохондриального рН. Окрашивание 10 µM 5-(and 6-)carboxy SNARF-1, acetoxymethyl ester, acetate 4 часа при КОМНАТНОЙ температуре.
CoroNa Red Chloride
Na+ - индикатор. Показана ко-локализация с MitoTracker Green FM. Накапливается спонтанно.
Lucigenin
Хемилюминисцентная проба люцигенин аккомулируется в митохондиях альвеолярных макрофагов. Используют высокие концентрации (~100 µM). В низких концентрациях отмечено подавление свечения при стимуляции генерации супероксида в митохондриях.

биотин карбоксилаза
Митохондрии могут быть прижизненно окрашены производными авидина или стрептавидина.
Окрашивание и фиксированного материала
Окрашивание митохондрий
с помощью конъюгации биотина с авидином.

АТ к альфа-тубулину и стрептавидин , конъюгированный с Alexa Fluor 488

Митотрекеры
MitoTracker and MitoFluor

JC-1

Kit Contents
• MitoTracker CMXRos dye (MW = 532, Component A), 50 μg
• Hoechst 33342 dye (Component B), 3 vials, each containing 400 μ L at 1.0 mM in water
• Dimethylsulfoxide (DMSO) (Component C), 500 μ L

Muntjac fibroblasts. Актин окрашен биотин-фаллоидином и стрептавидином, конъюгированным Alexa Fluor 350. Митохондрии окрашены MitoTracker Red CMXRos. Ядро окрашено антителами к фосфорелированным гистонам, вторые антитела - Alexa Fluor 500 goat anti–mouse IgG.

Культура клеток эндотелия, окраска MitoTracker Red CMXRos. Затем клетки фиксировали формалином, ДНК окрашено SYTO 16 green-fluorescent nucleic acid stain. МТ окрашены антителами к альфа-тубулину.

Клетки культуры эндотелия. Окраска MitoTracker Red 580 и DAPI после фиксации. Деконволюция.

JC-1 катионный карбоцианин, аккумулируется в митохондриях.
Краситель существует как мономер в низких концентрациях и светится как флуоресцеин.
В высоких концентрациях краситель формирует J-агрегаты, максимум эмиссии 590 nm. Чувствительный маркер потенциала.
JC-1
Культура преадипоцитов, окрашенных JC-1 (5 µM, 30 минут, 37°C).
Клетки обработали протонофором 50 nM FCCP.

JC-1; CBIC2(3)
5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide

Окрашивание кислого везикулярного
компартмента.
Наиболее часто используемые окрашивания:
1. DAMP – сам не светится, нужны АТ
2. Акридиновый оранжевый
3. Нейтральный красный
4. LysoTracker – быстрое окрашивание, стабильность окрашивания, разные цвета, 50 нМ, обычно сохраняется при фиксации. Разные лизотрекеры окрашивают лизосомы с разным рН.
– накапливаясть в лизосомах повышают рН, т.е. Инкубация должна быть до 5 минут.

Нейтральный красный – накапливается в лизосомах, можно использовать и для определения числа погибших и выживших клеток.
Данзил кадаверин (dansyl cadaverine). Связывается специфически с аутофагическими вакуолями, и, потом, с лизосомами. Не аккомулируется в ранних и поздних эндосомах. ???????
Акридиновый оранжевый – окрашивает так же ДНК и РНК .
Окрашивание кислого везикулярного
компартмента.

Фибробласты крысы, окраска LysoTracker Yellow HCK-123 и LysoTracker Red DND-99.

Культура клеток эндотелия. Окраска LysoTracker Red DND-99, a BODIPY derivative, and Hoechst 33342

ранние эндосомы
эндолизосомы

Окрашивание ЭПР
Карбоцианины DiOC,
Производные родамина
ER-Tracker
Высокие
концентрации
50 µM

ER-Tracker Blue-White DPX.

Окрашивание аппарата Гольджи
ЦЕРАМИД И ЕГО АНАЛОГИ.
NBD C6-ceramide
NBD C6-Sphingomyelin
BODIPY FL C5-ceramide
– флуоресцииновый фильтр,селективное окрашивание АГ.
– липиды мембран

Hoechst 33258, Hoechst 33342 and DAPI
Окрашивание нуклеиновых кислот используется в анализе клеточного цикла Hoechst 33258, Hoechst 33342 ( при связывании с ДНК усиление флуоресценции) и DAPI (связывается с АТ последовательностями нуклеотидов в ДНК). Hoechst 33342 более быстро проникает в клетки используется для определения количества ДНК в живых клетках без фиксации.
Ethidium Bromide и его аналоги
Этидиум бромид, этидиум гомодимер –1, пропидиум иодид и гексидиум иодид, интеркаляция между нуклеотидами. Красная флуоресценция. Не специфичны для ДНК. Поэтому используют РНК-азу при определения плоидности клеток.
Acridine Orange
Акридиновый оранжевый – зеленая флуоресценция при связывании с ДНК (двойная цепь) и красная флуоресценция при связывании с РНК (одиночная цепь).
Ядерные красители
SYTO
SYTOX

Intercalating dyes, such as ethidium bromide and propidium iodide
Minor-groove binders, such as DAPI and the Hoechst dyes
Other nucleic acid stains, including acridine orange, 7-AAD, LDS 751 and hydroxystilbamidine

Окрашивание цитоскелета:
микротрубочки
Oregon Green 514 tubulin
Oregon Green 488 paclitaxel
Viable HeLa cells were incubated with the conjugate for one hour, followed by several washes with phosphate-buffered saline containing 2% bovine serum albumin. The image was acquired using a confocal laser-scanning microscope and a filter set appropriate for fluorescein.

paclitaxel, Oregon Green 488 conjugate
paclitaxel, BODIPY FL conjugate
TubulinTracker Green

vinblastine, BODIPY FL conjugate
paclitaxel, BODIPY FL conjugate

Выживаемость клеток
Viability/Cytotoxicity Kit

1. Кальцеин CellTrace calcein green AM
Эстераза
CellTrace Calceins: Calcein AM, Calcein Blue AM and Calcein Red-Orange AM
2. МТТ
Сукцинатдегидрогеназа
формазан
3. Ethidium and Propidium Dyes
5. CellTracker Green CMFDA
Остается в живых клетках в течении длительного времени – несколько поколений.
Используют при трансплантации.

Кальцеин и этидиум бромид

Формазан в кератиноцитах человека

ROS – активные формы кислорода
Дигидро - родамин
Дигидро - флуоресцеин

Клетки культуры эндотелия.
Окраска на ROS –
6-carboxy-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, di(acetoxymethyl ester)
FM 5-95 (ранние эндосомы)
Hoechst 33342 (ДНК)
Деконволюция

Image-iT LIVE Reactive Oxygen Species (ROS) Kit . Клетки эндотелия, индукция оксидативного стресса tert-butyl hydroperoxide
Окрашивание carboxy-H2DCFDA.

Зворыкина 2012

Фагоцитоз, макрофаги

RedoxSensor Red CC-1 Stain
RedoxSensor Red CC-1 stain (2,3,4,5,6-pentafluorotetramethyldihydrorosamine.
Пассивная диффузия в клетку, в цитозоле окисляется – красная флуоресценция (540/600 nm). Аккомулируется в митохондриях.
Может транспортироваться в лизосомы, где и окисляется – флуоресценция в лизосомах.

RedoxSensor Red CC-1 Разное распределение в клетке зависит от рН цитозоля – либо в лизосомы,
– либо в митохондрии.
в пролиферирующих клетках – в митохондрии, при контактном ингибировании – в лизосомах.

Green Fluorescent Protein (GFP) зеленый флуоресцентный белок
Обнаружен впервые у Aequorea victoria (1761).
Клонирован в 1992 году.
Сейчас широко используется во всех лабораториях мира .
GFP

Люминисценция
Биолюминисценция (большинство морские виды): бактерии, динофлагелляты, радиолярии, грибы, многоножки, насекомые, улитки, ракообразные
Статическая
Генерация коротких вспышек (0,1-1 сек) в ответ на раздражение.

Сигнал должен быть хорошо заметен (нет промежуточных стадий яркости)
2. Люминисценция должна быть связана с определенной ситуацией
Эволюционное происхождение?
Симбиоз с бактериями
Секреторная
Смешивание веществ, световое облако
внутриклеточное
Биолюминисценция
около 30 вариантов

Osamu Shimomura

Aequorea victoria

1885 ДЮБУА
Термостойкий субстрат
люциферин
Фермент люцифераза
– не термостойкий
кислород
кальций
диоксетановая перекись
О, ROS
Индикаторы свободных ионов кальция

Гидроидные полипы колониальные (Obelia- обелин)
Гребневики
Радиолярии
Кальций (но не магний)
Люцифераза=акворин
Люциферин=целенторазин
Люцифераза
+перекись люциферина
Люцифераза
перекись люциферина
СО2
Синий свет
GFP
Зеленый свет
Индикаторы свободных ионов кальция

Douglas Prasher 1987г.

СТРУКТУРА
Кристаллическая структура GFP была описана в 1996 году. 11 Бетта-складки образуют бетта боченок альфа спираль проходят через центр. Хромофор располагается в середине боченка.

GFP- маркер синтеза белка и маркер активности гена
1. Флюоресценция при облучении УФ.
2. Маленькие размеры.
3. Линкеры
4. GFP флюоресциирует сам по себе. Люцифераза требует АТФ, магния и люциферина.
MSKGEELFTGVVPVLVELDGDVNGQKFSVSGEGEGDATYGKLTLNFICTTGKLPVPWPTLVTTFSYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFYKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKMEYNYNSHNVYIMGDKPKNGIKVNFKIRHNIKDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMILLEFVTAARITHGMDELYK
1992 г. 238 аминокислот.

Prof. Martin Chalfie (from the Biological Sciences, Columbia University web-site)
1988 г. –1994 гг. , Вставил ген GFP после промотора (C. Elegans) .
Ghia Euschirken
Экспрессия GFP в E. coli. 1994 Science.

Roger Tsien
Коллонии бактерий с различными флуоресцентными белками.

Производные GFP

Отличие GFP от его красного аналога, DsRed, в том, что хроматофор DsRed имеет extra double bond.

Лаборатория Лукьянова С.А.
Институт биоорганической химии РАН

Разноцветные флуоресцентные белки
Окрашивание нескольких структур в клетке
Большинство описанных к тому времени белков были зелеными
Мутантные белки – очень близкие спектры – более голубой и более желтый
Флуоресценция кораллов.
Флуоресценция кораллов.

Головастик шпорцевой лягушки, экспрессирующий флуоресцентные белки из коралловых полипов.

Мышь при освещении голубым светом, и та же мышь не освещенная. Актин-GFP.

Randy Prather, профессор репродуктивных биотехнологий в университете University of Missouri, Columbia,

Опухолевые клетки человека, экспрессирующие DsRed можно подсадить в такую мышь .
Можно исследовать образование метастаз или ангиогенез в опухоли .

Малярия

1. Флуоресцентный таймер
Меняют цвет с течением времени
Исследование синтеза белков – сначала синтезируемый белок зеленый, белок сменит цвет на красный – клетка станет желтая. Когда синтез прекратится, будет постепенно краснеть.
2. Разжигающий красный белок. Дает малиновую окраску клетки, сам не флуоресциирует. Облучили – засветился. Разжигание обратимое и необратимое (до года)
3. Фотопереключаемые производные PS-GFP (голубой-зеленый)
Dendra (зеленый-красный)
Исследования перемещения клеток, органелл, белков. Обмен содержимым между эндосомами.
4. Излучение в инфракрасной области iRFP...
5. Образование активных форм кислорода MiniSOG (mini Singlet Oxygen Generator)) KillerRed

4. Использование KillerRed для индукции гибели клетки при облучении ее светом.
Направленная инактивация клетки или белка.
Инактивация единичной клетки в эмбриогенезе

FRAP
Time
%F
Fluorescence recovery after photobleaching

FRET
ИНДУКТИВНО-РЕЗОНАНСНЫЙ (ФЕРСТЕРОВСКИЙ)
ПЕРЕНОС ЭНЕРГИИ
10-50А
fluorescence resonance energy transfer

pH сенсоры
1) не требуется проникновение эфиров и гидролиз низкомолекулярных красителей. Можно
измерять рН с малым фоновым сигналом и без вытекания индикатора из клеток в ходе экспериментов даже при 37 °С; отсутствует токсичность, связанная с применением химических индикаторов, и опасность повреждения, обусловленная инвазивным способом их введения.
2) GFP можно направить в определенные ткани, различные типы
клеток (используя специфичные промоторы), органеллы или в конкретные клеточные домены путем слияния с сигналом внутриклеточной локализации. Это позволяет измерять рН в специфических внутриклеточных участках.
3) С помощью мутагенеза можно изменять такие свойства индикатора, как рКа и динамический диапазон.
Cl-сенсоры

рН Сенсор

Сенсоры: кальций, цинк, медь….

Thermo fisher INVITITROGEN
Organelle Lights™ Intracellular
Targeted Fluorescent Proteins
Бакуловирус. Вирус насекомых. Наиболее известный Autographa californica,
Высокая эффективность трансфекции в разных типах клеток, включая стволовые.
Слабый цитотоксический эффект.
Вирус не опасен для млекопитающих.
Одновременная трансфекция разными генами.
Хорошо размножающийся вирус (высокий титр).
Evrogen, BacMam

Muntjac cell transduced with Organelle Lights Mito-GFP fluorescent protein. Cells were fixed prior to imaging.

OK (opossum kidney) cell transduced with Organelle Lights Golgi-GFP fluorescent protein.
Cells were fixed prior to imaging.

Figure 11.1.2 HeLa cell labeled with CellLight Actin-RFP (C10583 HeLa cell labeled with CellLight Actin-RFP (C10583, C10127 HeLa cell labeled with CellLight Actin-RFP (C10583, C10127) and CellLight MAP4-GFP (C10598) reagents and with Hoechst 33342 nucleic acid stain.

Calcium Related Applications
Probe Ratioing
Calcium Flux (Indo-1)
pH indicators (BCECF, SNARF)
Molecule-probe Excitation Emission
Calcium - Indo-1 351 nm 405, >460 nm
Calcium- Fluo-3 488 nm 525 nm
Calcium - Fura-2 363 nm >500 nm
Calcium - Calcium Green 488 nm 515 nm
Magnesium - Mag-Indo-1 351 nm 405, >460 nm
Phospholipase A- Acyl Pyrene 351 nm 405, >460 nm

Желатин, инсулин, казеин, дексаметазон (кортикостериоидные рецепторы)
Гистон Н1
Рециклирование везикул в синапсах FM 1-43
Субъединицы Cholera Toxin Subunit B
– проба на рафты
Декстран, микросферы
Трансферин, эпидермальный фактор роста
Флуоресцентные,
биотинилированные
Бактериальные липополисахариды
Коллаген, фибриноген
Фагоцитоз, эндоцитоз, транспорт в ядро