Оценка клеточной цитотоксичности

Контактный цитолиз
Рис.1. Этапы контактного цитолиза

Контактный цитолиз
Рис.2. Перфорин-гранзимовый механизм. Мирополость

Контактный цитолиз
Рис.3. Индукция апоптоза через Fas-рецептор

Антителозависимая клеточная цитотоксичность
Рис.4. Схема АЗКЦ (активация NK-клетки через FcγRIII)

Цитотоксические клетки
NK-клетки
CD8+ Т-лимфоциты

Активация NK-клеток
Рис.5. Варианты лиганд-рецепторого взаимодействия на NK-клетках

Лабораторные методы определения функции NK-клеток
Клеточная линия: клетки линии эритромиелоидного лейкоза человека К562
Оценка цитотоксичности по выходу 51Cr
Оценка клеточного цитолиза по ослаблению 3H-уридиновой метки
Метод оценки функциональной активности NK-клеток с использованием проточной цитометрии

Оценка цитотоксичности по выходу 51Cr
Принцип метода: основан на оценке цитолиза меченых клеток-мишеней, после их кратковременной инкубации с клеточными суспензиями, содержащими естественные киллеры. Цитолиз оценивается по выходу радиоактивной метки (51Cr), предварительно введенной в клетки

Оценка клеточного цитолиза по ослаблению 3H-уридиновой метки
Принцип метода: основан на оценке цитолиза меченых клеток-мишеней, после их кратковременной инкубации с клеточными суспензиями, содержащими естественные киллеры. Цитолиз оценивается по потере клетками предварительно введенной метки (3H-уридина).
Нормативы: 45,5±15,6 при разбросе данных 5,6-86%

Метод оценки функциональной активности NK-клеток с использованием проточной цитометрии
Принцип метода: окрашивание клеток-мишеней CFSE используется для их дифференцировки от эффекторных клеток. После совместной инкубации и окрашивания пропидия йодидом (который проникает только в погибшие клетки и взаимодействует с ДНК) оценивается гибель клеток мишеней по присоединению к зеленой флуоресценции красного флуоресцентого окрашивания пропидия йодидом.

Нормативы: спонтанная гибель клеток линии К562 в контрольных пробах составляет 3,6±1,%

Активация CD8+ T-лимфоцитов
Рис.7. Схема развития цитотоксического T-клеточного ответа

Активация CD8+ T-лимфоцитов
Рис.8. Схема активации CD8+ T-лимфоцита и распознавание клетки-мишени

Лабораторные методы определения функции Т-лимфоцитов
Определение реакции Т-клеток на антигены MHC в СКЛ.
Определение антигенспецифических T-лимфоцитов с использованием MHC-пептидных тетрамеров. .
Метод определения цитолитической активности цитотоксических Т-лимфоцитов.
Определение цитолитичеких CD8+ T-клеток с помощью реакции специфической дегрануляции.
Реакция торможения миграции лейкоцитов.

Определение реакции Т-клеток на антигены MHC в СКЛ
Цель теста: оценка пролиферативной реакции отвечающих клеток на действие клеток-стимуляторов, точнее на аллогенные молекулы MHC, которые они несут.

Определение антигенспецифических T-лимфоцитов с использованием MHC-пептидных тетрамеров.
Проблема 1: низкий процент клеток конкретных клонов Т-лимфоцитов
Проблема 3: невозможность прочного связывания растворимых лигандов с TCR
Данные проблемы были решены с помощью сборки тетрамерных структур

Метод синтеза тетрамеров
Получение тяжелой цепи MHC-I, содержащей участок для биотинилирвоания
Создание комплекса модифицированной тяжелой цепи MHC-I с β2 – микроглобулином и специфическим антегенным пептидом
Биотинилирование комплекса MHC-пептид
Синтез тетрамера

5’ HLA-A2 gene 3’
+
Sequence for biotinнliation
5’ HLA-A2 gene 3’
Sequence for biotinylation
E.Coli’s plasmide

Применение метода
Контроль за численностью клеток в клонах и её динамикой при инфекционных процессах, аутоиммунной патологии, злокачествтенных опухолях, вакцинации, а также при трансплантации тканей
Выделение антигенспецифических клеток, пригодных для использования с целью иммунотерапии
Тетрамеры на основе пептидов, комплексированных с молекулами MHC, используются для локализации Т-клеточных эпитопов в макромолекулах
Предполагается использование тетрамеров, содержащие кроме молекул MHC пептидов, цитотоксические агенты для прицельной элиминации патологических клонов Т-клеток при аутоиммунных процессах (показано в опытах на мышах)

Метод определения цитолитической активности цитотоксических Т-лимфоцитов.
Определение активности иммунных цитотоксических Т-лимфоцитов отличается от оценки активности NK-клеток только наличием этапа индукции цитотоксических T-лимфоцитов
Реакция определения цитолиза, опосредованного цитотоксическими T-лимфоцитами, представляет с собой совмещение методов СКЛ и оценки спецфического цитолиза клеток-мишеней, меченных 51Cr.
Ограниченность применения реакции обусловлена главным образом тем, что она дает информацию только о цитотоксическом ответе на MHC-антигены (HLA I класса).

Определение цитолитичеких CD8+ T-клеток с помощью реакции специфической дегрануляции.
В состав мембраны цитотоксических гранул входит антиген CD107a (LAMP-1), который является специфическим макером гранул и отсутствует на поверхности неактивированных CD8+ T-лимфоцитов.
Метод позволяет идентифицировать именно цитолитические антигенспецифические Т-клетки.
Количественным.
Высокочувствительным.
Нормативы
Спонтанная дегрануляция – 0,2±0,1%
Дегрануляция, индуцированная МАТ к CD3, - 7,5±06,8%

Клиническая значимость и показания к использованию
Реакция дегрануляции CD8+ Т-лимфоцитов может применяться в комплексе оценки Т-клеточного иммунитета.
Применяется при:
Мониторинг цитолитической функции Т-клеток при различных вирусных инфекциях и др, вызванных внутриклеточным патогеном.
Мониторинг специфического Т-клеточно иммунитета, у лиц, получающих вакцинные препараты
Мониторинг специфического Т-клеточно иммунитета, у лиц, получающих противоопухолевые терапевтические вакцины

Реакция торможения миграции лейкоцитов
Принцип метода: Метод основывается на определение активности факторов, модифицирующих миграцию макрофагов, которые секретируются сенсибилизированными лимфоцитами при их рестимуляции in vitro. Как правило наблюдается торможение миграции, реже – ее усиление.