Превращение микроорганизмами соединений азота. Тема 7

Круговорот азота в природе
Азот является важнейшим органогенным элементом, который входит в состав белковых веществ, ферментов, АТФ, нуклеиновых кислот любого живого существа.
Азот в природе находится в трех формах:
1. Органическая форма азота (белки, ферменты, нуклеиновые кислоты);
2. Минеральная форма азота (аммиак, нитраты, нитриты);
3. Молекулярная форма азота (N2 – в атмосфере).
Атмосферный азот вовлекается в круговорот благодаря азотфиксирующим микроорганизмам.
Растения усваивают фиксированный м/о азот и превращают его в растительный белок.
Животные поедают растительный белок и образуют животный белок.

Цикл превращений азота в природе с участием микроорганизмов состоит из 4 этапов:
аммонификация белковых веществ;
Нитрификация;
Денитрификация;
фиксация атмосферного азота м/о.

Аммонификация (минерализация азота, гниение, мобилизация азота) - это разложение органических азотсодержащих веществ с выделением азота в виде аммиака (белки, ферменты, мочевина, хитин, нуклеиновые кислоты).
Значение:
1. Участие в круговороте веществ в природе, санитары планеты, очищают от растительных, животных и микробных остатков, гнилостные процессы используют при выделке кож.
2. Порча мяса и мясопродуктов, рыбы и рыбопродуктов, яиц, молока и других белковых продуктов, шелковых и шерстяных тканей и изделий.

Аммонификация белков.
Разложение идет в 2 фазы:
1-я фаза протеолиз белков по схеме:
Белки = (экзопротеазы, пептидазы) = пептон = полипептиды = олигопептиды = аминокислоты.
2-я фаза аминокислоты поглощаются клетками микроорганизмов и внутри них происходит дезаминирование и декарбоксилирование.

Дезаминирование – отщепление аминогруппы
H
R-C-COOH
NH2
Виды дезаминирования
– востановительное
RCHNH2COOH + 2Н+ = RCH2COOH + NH3
– окислительное
RCHNH2COOH + 1/2О2 = RCОCOOH + NH3
– гидролитическое
RCHNH2COOH + H2O = RCНОНCOOH + NH3
– прямое
RCH2СНNH2COOH + H2O = RCН=СНCOOH + NH3
Декарбоксилирование – отщепление СО2
RCHNH2COOH = RCH2NH2 + CO2

Продукты аммонификации

Возбудителями аммонификации являются аммонифицирующие (гнилостные) бактерии. Широко распространены в природе.
Характеристика:
Грам+ и грам -;
палочки;
подвижны;
споровые и неспоровые;
мезофиллы;
аэробы, факультативные и облигатные анаэробы;
гетеротрофы.

Аэробы:
– грибовидная бацилла Bacillus mycoides
– картофельная палочка Bacillus mesentericus
– сенная палочка Bacillus subtilis
– фосфорная палочка Bacillus megaterium
– чудесная палочка Bacterium prodigiosum
– Pseudomonas fluorescens
Факультативные анаэробы:
– протей обыкновенный Proteus vulgaris
– кишечная палочка Escherichia coli
Облигатные анаэробы:
– гнилостная палочка Clostridium patrificus
– спорогенная палочка Clostridium sporogenus
Аммонификацию в аэробных условиях вызывают плесневые грибы и актиномицеты.

Аммонификация мочевины.
Мочевина – продукт разложения белков в организме человека и животного, выделяющийся наружу с мочой.
Азот мочевины растениям не доступен. Только после его аммонификации микроорганизмами он переходит в форму NH3 и становится доступным.
Под действием фермента уреаза, который выделяют микрооорганизмы, происходит гидролиз мочевины с образованием карбоната аммония, который почти тотчас же разлагается на составные компоненты - NH3, H2O, CO2.
Химизм:
CО(NH2)2 + Н2O = уреаза = (NH4 )CО3 (углеаммиачная соль) = 2NH3 + CO2 + H2O

Возбудители:
Уробактерии, содержат фермент уреаза, широко распространенный в почве, навозе, сточных водах.
Характеристика:
Грам+, кокки, палочки, подвижны, споровые, аэробы, алкалофилы (рН 8-10), ауксоавтотрофы, аминоавтотрофы.
Более слабо могут вызывать аммонификацию бактерии рода Pseudomonas и Cytophaga.

Аммонификация хитина.
Хитин – это вещество хорошо распространено в почве. Входит в состав панциря ракообразных, покров насекомых, клеточную стенку грибов.
Очень стойкое соединение.
Хитин – это азотсодержащий полисахарид (C18H30O12N2)
Химизм:
C18H30O12N2 + 4H2O = хитиназа = 2C6H11O5NН2 (глюкозамин) + CН3COOH
2C6H11O5NН2 (глюкозамин) + 2H2O =хитиназа = 2C6H12O6 (глюкоза) + NН3

Возбудители:
– актиномицеты – стрептомицеты, проактиномицеты, микромонаспоры.
– плесневые грибы – мукор, аспергиллус.
– бактерии – bacterium chitinovorum, pseudomonas, cytophaga
При аммонификации выделяется NН3 часть которого:
– используется растениями
– усвоят микробы
– закрепится в почве
– улетучится
– окислится при нитрификации.

Нитрификация.
Это процесс окисления аммиака или аммиачных форм азота сначала в азотистую кислоту или нитриты, которая затем окисляется в азотистую кислоту или нитриты.
Процесс окисления идет в 2 фазы:
1-я фаза нитрозная: 2NH3 + 3O2 = 2HNO2 + 2H2O + 285 кДж
2-я фаза нитратная: 2HNО2 + O2 = 2HNO3 + 87 кДж
Возбудители первой фазы – нитрозные бактерии, окисляют аммиак.
1. род Nitrosomonos 2. Nitrosospira
3. Nitrosococcus 4. Nitrosolobus
5. Nitrosovibrio 6. Nitrosocystis

Возбудители второй фазы – нитратные бактерии, окисляют азотистую кислоту.
1. род Nitrobacter
2. Nitrospira
3. Nitrococcus
Характеристика:
Грам + ;
кокки, палочки, извитые, дольчатые;
подвижные и неподвижные;
неспоровые;
вызывают процесс окисления, аэробы;
у всех есть мембраны на которых происходит хемосинтез, хемолитоавтотрофы;
энергию которую получают при окислении аммиака или азотистой кислоты используют для построения органического вещества.

Факторы, влияющие на нитрификацию:
1. Наличие кислорода;
2. Кислотность рН 6-9;
3. Оптимальная температура 28-30 0С;
4. Органическое вещество подавляет нитрификацию;
5. Влажность 40-60%.
Значение:
1. Образование залежей селитры;
2. Служит показателем микробиологической активности почвы и ее плодородия;
3. Нитраты и нитриты усваивают растения.
Отрицательное значение:
1. Нитраты легко вымываются из почвы.

Денитрификация.
Это процесс восстановления нитратов и нитритов до молекулярного азота.
Значение:
1. Она носит отрицательный характер, т.к. почва теряет доступную форму азота для растений.
2. С другой стороны денитрификация происходящая в мировом океане полезна, т.к. обезвреживаются нитраты.

2 вида денитрификации:
1. Прямая (микробиологическая) – биологическое восстановление нитратов в результате деятельности микробов.
– ассимиляторная – большой роли не играет. Микробы используют азот нитратов для построения органического вещества:
NO3 → NO2 → NO → NH4OH → NH4 → аминокислоты → белок → NH3
– диссимиляторная – микробы используют кислород нитрата для получения энергии в результате нитратного дыхания:
NO3 → NO2 → NO → N2O → N2

Возбудители – денитрифицирующие бактерии:
Pseudomonas fluorescens
Pseudomonas studzeri
Paracoccus denitrificans
Характеристика:
Грам - ;
палочки, кокки;
неспоровые;
подвижные;
гетеротрофы;
факультативные анаэробы:
Есть кислород – окисление:
С6Н12О6 + 6О2 = 6СО2 + 6Н2О + эн.
Нет кислорода – нитратное дыхание:
5С6Н12О6 + 24KNО3 = 24KHСO3 + 6СО2 + 18Н2О + 12N2 + эн.
Условия для прохождения денитрификации: анаэробные.
Мера борьбы: обработка почвы.

2. Косвенная (химическая) – это химическое восстановление нитратов, которое происходит только в кислой среде рН мене 5,5.
RCHNH2COOH + HNO3 = RCНОНCOOH + Н2О + N2
Меры борьбы: известкование почв.

Иммобилизация азота.
Это использование микроорганизмами аммиачного азота для построения своего органического вещества.
Перевод аммиачного азота в тело микробов.
Процесс обратный аммонификации.
Значение:
1. Процесс носит отрицательный характер, т.к. азот становится недоступным для растений.
2. Поздно осенью иммобилизация полезна, т.к. азот закрепляется в почве и не вымывается.

Соотношение в почве процессов аммонификации и иммобилизации зависит от баланса углерода к азоту в органическом веществе почвы.
У микроорганизмов на каждые 100 г органического вещества приходится 50 г углерода и 2 г азота.
Идеальный баланс углерода к азоту в почве для микроорганизмов 25:1.
При узком соотношении менее 25:1 в почве преобладает аммонификация над иммобилизацией.
Например: при внесении в почву сушенной крови (соотношение углерода к азоту 4:1), микробы чтобы получить углерод разлагают это вещество и выделяют аммиак.

При широком соотношении более 25:1 в почве преобладает иммобилизация над аммонификацией.
Например: при внесении в почву соломы (соотношение углерода к азоту 100:1) микробы, чтобы получить азот, добирают его в аммиачной форме.
Иммобилизованный азот является биологически связанным (закреплен) в теле микробов. После их отмирания происходит реминерализация иммобилизированного азота с выделением аммиака.

Биологическая азотфиксация.
Азотфиксация - это процесс, характерный только для прокариотической клетки, усвоение молекулярного азота азотфиксирующими микроорганизмами для построения своего органического вещества.
Способны фиксировать молекулярный азот:
Сине-зеленые водоросли (Цианобактерии);
Аэробные и анаэробные бактерии;
Некоторые актиномицеты (Франки).

6. Биологическая азотфиксация

Фермент способный разорвать эту связь – нитрогеназа
Химизм: Процесс усвоения азота происходит по восстановительному пути:
Схема восстановления:
N≡N + 2Н →Мо→ НN=NН + 2Н→Н2N=NН2 + Н2 → 2NН3 → R–CH2–COOH
(диимид) (гидразин) (аминокислота)
Процесс играет огромную роль в природе, так как происходит превращение азота в доступные для растений формы, повышается почвенное плодородие.
БИОЛОГИЧЕСКАЯ АЗОТФИКСАЦИЯ - усвоение некоторыми микроорганизмами молекулярного азота атмосферы и перевод его в органические соединения (образуют аммиак, который служит исходным веществом для образования белков).
N2 N≡N энергия этой связи 225 ккал.

Микроорганизмы, способные фиксировать молекулярный азот:
Сине-зеленые водоросли (цианобактерии род Nostoc, Anabaena);

2. Симбионты небобовых растений – род Frankia (Франки)
Frankia on the roots of Shepherdia argetea (Шефердия серебристая).
Symbiotic N-fixation in Alnus viridis
(Ольха зелёная)

3. Бактерии:
3.1. Свободноживущие:
– Аэробы (Род Azotobacter);
– Анаэробы (Род Clostridium).
3.2.Симбиотические:
– Симбионты бобовых растений (Род Rhizobium).

СВОБОДНОЖИВУЩИЕ АЗОТФИКСАТОРЫ
Живут в почве самостоятельно и используют молекулярный азот для построения органического вещества, после их отмирания они минерализуются, а азот выделяется в виде аммиака.
Накапливают до 40 кг/га азота.
Анаэробные свободноживущие азотфиксаторы:
Наиболее сильная азотфиксирующая способность у маслянокислой бациллы – Clostridium pasteurianum.
Фиксирует 5-10 мг азота на 1 г потребленного источника углерода.

Характеристика: Грам+, палочки, подвижные, споровые, спорорасположение клостридиальное, запасное вещество гранулеза, облигатные анаэробы, используют моно- ди- и полисахариды, геторотрофы.
Широко распространен в наших почвах. Встречается в почвах с рН от 4,5 до 9, оптимальная рН = 7.
Оптимальные условия для его развития:
– анаэробные условия;
– нейтральная среда;
– влажность 60-80% ПВ;
– наличие органического вещества.

Другие анаэробные свободноживущие азотфиксаторы:
1. Clostridium butylicum
2. Clostridium pectinovorum
3. Clostridium оmelianum
4. Коринебактерии
5. Зеленые и пурпурные серные бактерии

Аэробные свободноживущие азотфиксаторы.
Открыты в 1901 году Бейеринком (Azotobacter chroococcum).
Относятся к семейству Azotobacteriaceae
Род. Azotobacter
Представители:
1. Azotobacter chroococcum;
2. Azotobacter vinelandii;
3. Azotobacter agilis.
Фиксирует 10-15 мг азота на 1 г потребленного источника углерода.

Характеристика:
Грам- , в молодом возрасте подвижные палочки с возрастом становятся неподвижными крупными кокками. Кокки соединяются попарно и покрыты общей капсулой, неспоровые, аэробы, гетеротрофы, используют моно- ди- и полисахариды, ароматические вещества.
Азотобактер требователен к плодородию и окультуренности почвы.
Оптимальные условия для его развития:
– аэробные условия;
– рН – 7,2-8;
– влажность 60-80% ПВ;
– наличие органического вещества;
– высокая потребность в фосфоре, калии, кальции, молибдене, боре.

Azotobacter chroococcum используется для микробной индикации плодородия и окультеренности почв.
Этот микроб выделяет биологические активные вещества: витамины, гормоны, антибиотики против патогенов, ферменты.
Из него готовят бактериальное удобрение азотобактерин (ризофил).
Обрабатывают этим удобрением семена перед посевом не бобовых культур: овощные, картофель, зерновые только на плодородных окультуренных почвах. При этом прибавка урожая составляет 20-30%.

Другие представители семейства Azotobacteriaceae:
Род. Beijerinekia (Бейеринкия)
Распространен в почвах южного полушария, образует слизистые красно-коричневые колонии. Любит кислые почвы, отличается кальцефобностью;
Род. Azomonas
Распространен в почвах тропиков;
Род. Derxia
Распространен в почвах тропиков, образует коричневые колонии, красноземы.

Цианобактерии – сине-зеленые водоросли.
Могут фиксировать молекулярный азот, как в симбиозе, так и в свободноживущем состоянии.
Свободноживущие цианобактерии есть в почвах всех типов. Фиксируют азот только многоклеточные цианобактерии: Nostoc и Anabaena.
Характеристика:
Аэробы, влаголюбивые, нейтрофилы, фотолитоавтотрофы, 70-100 кг азота на 1 га.
Широко используют как бактериальное удобрение, особенно при выращивании риса.

АССОЦИАТИВНЫЕ АЗОТФИКСАТОРЫ.
Занимают промежуточное положение между свободноживущими и симбиотическими азотфиксаторами.
Как свободноживущие, они живут самостоятельно и имеют свой собственные механизм азотфиксации. Как симбиотические, они имеют более тесное отношение с растениями.
Ризосфера – около корня.
Ризоплана – на поверхности корней.
Эпифиты – живут на поверхности растений, а некоторые проникают внутрь корней, листьев, стеблей.
Эффект от них выше, чем от свободноживущих.

К ассоциативным бактериям относят:
Азоспирилла – azospirillum
Впервые выведен из ризосферы. В настоящее время широко практикуется использование азоспириллы, как бактериального удобрения.
Klebsiella
Мелкая палочка, капсульная, неподвижная, неспоровая, факультативный анаэроб.
Flavobacterium
Палочки, неспоровые, подвижные. Развиваются в ризосфере кормовых трав.

Ризобактерин
Основа биопрепарата: ассоциативные азотфиксирующие бактерии Klebsiella planticola
Диазофит
Мизорин
Из ассоциативных бактерий готовят бактериальные удобрения:

СИМБИОТИЧЕСКИЕ АЗОТФИКСАТОРЫ.
Фиксируют азот атмосферы живя только в симбиозе.
К ним относят:
Цианобактерии – они образуют экзосимбиоз с грибами – лишайники (при более низкой температуре).
Симбиоз с водными папоротниками – азотфиксирующая способность 100-120 кг/га азота. Азотфиксация идет при повышенной влажности и температуре.
Актиномицеты (франки) – симбиоз с покрытосеменными высшими растениями. Они образуют клубеньки, которые называются актинориза.
В европейских странах используют для обработки семян и корней (инокуляция).
Клубеньковые бактерии бобовых растений = ризобии. Образуют эндосимбиоз (внутри ткани). Относятся к роду Rhizobium.

Свойства клубеньковых бактерий:
1. Вирулентность – способность проникать и развиваться внутри ткани корня;
Симбиотическая фиксация азота в корневых клубеньках бобовых:
1 – корень гороха с клубеньками;
2 – клубеньки в разрезе;
3 – растительная клетка в разрезе, заполненная бактериями;
4 – бактерии, находящиеся в клетках растения приобретают необычную форму;
5 – внедрение бактерий через кончики корневых волосков, и рост инфекционных нитей

2. Активность – способность фиксировать азот атмосферы;
Азотфиксирующая способность клубеньковых бактерий:
Однолетние травы 50-100 кг/га азота
Многолетние травы 150-300 кг/га азота.

3. Специфичность – разным видам бобовых растений присущи определенные виды клубеньковых бактерий:
Rhizobium trifolii – клевер;
Rhizobium leguminosarum – горох, бобы, вика, чина;
Rhizobium phaseoli – фасоль;
Rhizobium lupini – люпин;
Rhizobium jponicum – соя.
Бактероиды (под микроскопом):
I - посевной вики; II - клевера; III - люцерны; IV - мохнатой вики

Характеристика:
Грам- , молодые клетки палочки, подвижны, азот фиксировать не могут.
Попадая в растение они теряют подвижность и переходят в состояние «опоясанных палочек», которые образуют бактероиды. Именно бактероиды фиксируют азот атмосферы.
По форме они различные: т-образная, у-образная, сферическая, грушевидная и др. Крупные, неподвижные.
Клубеньковые бактерии неспоровые, гетеротрофы, нейтрофилы и мезофилы.

Активные клубеньки более крупные, находятся ближе к стеблю и имеют розовую окраску. Неактивные – на периферии и более мелкие.
Клубеньки на корнях:
люпина люцерны фасоли вики

Суть симбиоза: растение обеспечивает бактерии органическим углеродом и условиями для жизни, а бактерии обеспечивают растение азотом на 2/3 их потребности.
Оптимальные условия для клубеньковых бактерий:
1. рН = 6,5-7,5, min - 4,0-4,5;
2. Температура 24-26, min ниже 0 и выше 35;
3. Влажность 60-70% ПВ, min -16%;
4. Р и К усиливают азотфиксацию;
5. Микроэлементы В и Мо усиливают азотфиксацию;
6. Азот минеральных удобрений подавляет азотфиксацию.

Из клубеньковых бактерий готовят бактериальные удобрения:
Нитрагин
Две его формы:
1. Ризоторфин – торфяной нитрагин
2. Ризобин – порошковый нитрагин
Обрабатывают семена перед посевом бобовых растений и строго специфично – бактеризация или инокуляция семян.
Прибавка урожая составляет 30-40%.

Развитие корневой системы при применении Ризоторфина

Ризофос
3-х марок:
«Галега» на основе клубеньковых бактерий Rhizobium galegae
«Люцерна» на основе клубеньковых бактерий Rhizobium meliloti
«Клевер» на основе клубеньковых бактерий Rhizobium trifolii
Норма внесения: 200мл на 1 гектарную норму высева семян

СояРиз
на основе клубеньковых бактерий
Rhizobium japonicum
Норма внесения: 200г /гектарную норму семян
Сапронит
Состав: живая культура симбиотических азотфиксирующих бактерий рода Rhizobium, специфических для каждого вида бобовых растений.

Вогал
Основа биопрепарата: клубеньковые бактерии Rhizobium galegae
Ризобофит (Украина)