Культивирование клеток in vitro

Культивирование
Культуры клеток представляют собой гомогенную популяцию генетически однородных клеток, растущих в постоянных условиях.
Исследователь может изменить эти условия в определенных пределах, что позволяет ему оценить влияние на рост клеток различных факторов-рН, t, концетрации АК,витаминов, и т.д.

Преимущества по сравнению с исследованиями на животных:
Возмощность пожизненного наблюдения клеток с помощью микроскопа
Рост клеток может быть оценен в течении короткого периода времени либо по увеличению числа или размера клеток
Существенные результаты могут быть получены при использовании небольшого кол-ва клеток
При введении исследуемого хим.в-ва нет опасности, что оно метаболизируется печенью, запасается мышцами или экскретируется почками
Реальные значения скорости включения или метаболизма исследуемых соединений

Эксперименты, требующие для выяснения того или иного вопроса использования 100 крыс или 1000 человек, могут быть с равной статистической достоверностью поставлены на 100 культурах на покровных стеклах.
Если каждую клетку рассматривать как независимый объект эксперимента, то одна культура на покровном стекле даст более достоверный ответ, чем целая клиника больных.
Это снимает этические проблемы
Важное преимущество, когда дело касается человека…

Применение
Культивирование позволило глубоко проникнуть в механизмы роста и дифференцировки клеток.
Способнось клеток к росту в культуре привела к развитию методов клонирования, хранения и слияние клеток.
Крупномасштабное про-во моноклональных Ат (кл.селезенки+кл.миеломы)
КК-ценные источники гормонов и др.секретируемых материалов.
Тестирование и изучение на КК м-ма д-я различных ЛП, детергентов, косметических средств, инсектецидов, консервантов

Первичные клетки
Термином «первичная» обозначают клеточную культуру, полученную непосредственно из тканей человека или животных в эмбриональном или постнатальном периоде. Срок жизни таких культур ограничен. По прошествии определенного времени в них возникают явления неспецифической дегенерации, что выражается в грануляции и вакуолизации цитоплазмы, округлении клеток, утрате связи между клетками и твердым субстратом, на котором они выращивались. Периодическая смена среды, изменение состава последней и другие процедуры могут лишь несколько увеличить сроки жизни первичной клеточной культуры, но не могут предотвратить ее конечной деструкции и гибели. По всей вероятности, этот процесс связан с естественным угасанием метаболической активности клеток, выведенных из-под контроля нейро-гуморальных факторов, действующих в целостном организме.

Первичные клетки человека
Лимфоциты –служат идеальным источником ткани человека для изучения генеических заболеваний. Требуют митогенной стимуляции, претерпевают несколько делений, затем гибнут.
Фибробласты кожи также имеют ограниченный более продолжительный период жизни в культуре, но их редко удается получить в таком же кол-ве.

Лимфоциты
Кровь отбирают в сосуд с гепарином
Отстаивают 40 мин
Обогащенную плазму отсасывают и центрифугируют
Вносят в питатьельную среду(для индукции бластогенеза вносят митоген)
Инкубируют сутки

Культура фибробластов
Биопсия кожи человека(выбор участка без волос и минимально кератинизирован)
Стерилизация участка 70% этанолом, с помощью хирургических щипцов взять кусочек кожи
Острыми ножницами вырезать блок 1мм3 и поместить его в чашку Петри
Добавить каплю полной ростовой среды с эмбриональной сывороткой теленка и разрезать блок на 10-15 кусочков
Распределить их по поверхности чашки и покрыть каждый каплей среды
Инкубировать ночь
Осторожно,чтобы не сместить фрагменты,добавляют 3 мл среды и продолжить инкубацию

Перевиваемые клетки
Лишь отдельные клетки или группы клеток популяции на фоне дегенерации большей части клеточного пласта могут сохранить способность к росту и размножению. Эти клетки, обнаружив потенцию бесконечного размножения in vitro, при многократных перевивках дают начало перевиваемым культурам клеток.
Основное преимущество линий перевиваемых клеток, по сравнению с любой первичной культурой, состоит в потенции неограниченного размножения вне организма и относительной автономности сближающей их с бактериями и одноклеточными простейшими.
Способность перевиваемых клеток к бесконечному размножению in vitro знаменует собой качественный скачок, в результате которого клетки приобретают способность к автономному существованию, подобно микроорганизмам, выращиваемым на искусственных питательных средах. Совокупность изменений, приводящих к появлению у клеток таких особенностей, называют трансформацией, а клетки перевиваемых тканевых культур — трансформированными.

Направления в культивировании животных
Суспензионные культуры предпочтительнее с точки зрения увеличения выхода клеток.
Монослойные культуры обладают рядом преимуществ

Преимущества Монослойных культур
1.Легко провести полную замену среды и промыть клетки перед добавлением свежей питательной среды. Это важно в тех случаях, когда рост клеток идет в одних условиях, а наработка продукта в других условиях, например при переносе клеток из среды с сывороткой в бессывороточную среду. Можно также полностью удалять нежелательные компоненты.
2. Позволяют обеспечить высокую плотность клеток.
3. У многих клеток экспрессия требуемого продукта идет эффективнее, если клетки прикреплены к субстрату.
4. Монослойные культуры могут быть использованы для любого типа клеток, что обеспечивает наибольшую гибкость исследований.
5. В некоторых случаях, например для распространения вирусов, требуются тесные межклеточные контакты.
.

Недостатками монослойных культур
требования большого пространства;
возрастание стоимости и трудоемкости при увеличении масштаба;
недостаточно эффективный контроль, обусловленный трудностями отбора пробы;
сложности в определении и контролировании рН, концентрации кислорода

Формирование монослоя

Суспензионные культуры
Лимфоциты не обнаруживают тенденции к агрегации к поверхности стекла или пластика и выживают на дне сосуда под тонким слоем среды.
Другие клетки,если не перемешивать суспензию, могут осаждаться и прикрепляться к субстрату.

Направления культивирования
1. Культивирование в плоских флаконах (матрацах).
2. Культивирование во вращающихся бутылях, когда в каждый момент времени 1520% поверхности бутыли покрыто питательной средой, а клетки находятся попеременно то в среде, то в воздухе.
3. Культивирование в колонках на микроносителях, в качестве которых выступают плотно упакованные, не смещающиеся стеклянные бусы диаметром 35 мм, стопка пластин и др., а питательная среда омывает их, протекая сверху вниз

Работа в культуральной лаборатории
Как правило, лаборатория, где проводят работы с культурами клеток, состоит минимум из 3-х помещений. Это бокс, где ведутся стерильные работы; комната для приготовления питательных сред, хранения химикатов, оборудования и т.д.; автоклавная.

Подготовка бокса к работе
Непосредственно перед работой необходимо протереть внутренние поверхности ламинара этиловым спиртом, разложить в нем необходимые инструменты и материалы: спирт в закрытой посуде, спиртовку (горелку), спички, пинцет, серологические пипетки, резиновую спринцовку и культуральную посуду.
Все операции, связанные с разливом питательных сред, пересевом клеточных культур проводят в ламинарах.

Посуда
Выбор посуды:
Растут ли клетки в монослое или суспензии?
Масштаб эксперимента
Допустим ли газообмен с атмосферой или культуральные сосуды должны быть закупорены?

Газообмен обеспечивает поддержание рН, который контролируется по цвету среды(феноловый красный)-чашка Петри.
Закупоренные сосуды-бутылки с пробкой или крышкой(буфер Hepes\бикарбонат

Мелкомасштабные культуры
Бутыль Ру
Плоские медицинские бутыли(125,250 мл)
Флакон Фалькона
Пластинки Линбро и Фалькона(24 лунки)
Пластинка для микротитрования(96 лунок)
Универсальные контейнеры

Крупномасштабные культуры
Вращающиеся сосуды
Фабрика клеток(мультипластинчатые блоки из 10 спаянных друг с другом пластин)
Перфузионные сосуды(аппараты, обеспечивающие постоянную перфузию вращающихся бутылок с помощью вращающихся пробок,через которые проходят различные питающие трубки )
Капиллярные подложки

Стерилизация посуды
Вначале посуду тщательно моют с использованием детергентов, а также раствора двухромовокислого калия в серной кислоте (хромпика). Вымытую посуду ополаскивают водопроводной, затем дистиллированной водой и высушивают в сушильном шкафу .
При сухом способе стерилизации посуду, завернутую в плотную бумагу, стерилизуют в сушильном шкафу при температуре 140°С в течение 2 часов, при температуре 180°С - 30 минут. При более высоких температурах ватные пробки буреют, а бумага становится ломкой.

Посуду выдерживают в автоклаве (рис. 2, б) под давлением в течение 20-40 минут при температуре 100-130°С. Продолжительность автоклавирования зависит от его режима: при давлении 0.5 атмосферы - 20-40 минут, при 1 атм. - 15 минут.

Среды для культуры клеток
1955г. Игл провел анализ компонентов для роста клеток млекопитающих.
БСИ:12 незаменимых АК, 9 витаминов; глутамин, антибиотики добавляют вместе с 5% сывороткой КРС(требует ежедневной смены)
МСИ:10-кратный концентрат требует разведения дистиллированной водой и послед.добавления глутамина, сыворотки, бикарбоната, антибиотиков.

Состав среды Игла
1. л-аргинина - 17,4
2. л-цистина - 4,8
3. л-гистидина - 3,1
4. л-изолейцина - 26,2
5. л-лейцииа - 13,1
6. л-лизина - 14,6
7. л-метионина - 7,5
8. л-фенилаланина - 8,3
9. л-треонина - 11,9
10. л-триптафана - 2,0
11. л-тирозина - 18,1
12. л-валина - 11,7
13. биотина - 0,24
14. холина - 0,12
15. холин-хлорида - 0,14
16. витамина В12 (птероилглютаминовой кислоты) - 0,44
17. никотинамида - 0,12
18. пантотеновой кислоты - 0,22
19. пантотената кальция - 0,48
20. пиридоксаля (пиридоксин хлоргидрата) - 0,20
21. тиамин-хлоргидрата - 0,34
22. рибофлавина - 0,04
23. хлористого натрия - 5850,0
24. хлористого калия - 373,0
25. фосфата натрия однозамещенного (NaH2PO4 . Н2О) - 138,0
26. кальция хлористого - 111,0
27. двууглекислого натрия (NaHCO3) - 1680,0
28. магния хлористого (MgCl2 . 6Н2О) - 102,0
29. глюкозы - 900,0
30. л-глютамина - 146,2—292,3
31. пенициллина - 50,0
32. стрептомицина - 50,0
33. фенола красного - 5,0
34. воды до 1000,0

Сбалансированные солевые растворы
Среды составляют на основе сбалансированных буферных солевых растворов, которые важны для снабжения клеток необходимыми ионами и поддержания осмотического баланса(СБСР Эрла, Хенкса).
Правильное значение рН=7.2-7.5
Подщелачивание-красная
Закисление-желтая
Ионы Са-прикрепление клеток к поверхности
Ионы Na,К-осмотический баланс

Усложненные среды (для отдельных линий)
Среда Мак-Коя 5А-стандартная для клонирования(модифицирована в RPMI-1629)
Среда Хэма F10-клонирование диплоидных клуток яичников хомяка(в присутствии min сыворотки)
CMRL, NCTC-в отсутсвие сыворотки