Загальна характеристика родини POLYOMAVIRIDAE

Родина POLYOMAVIRIDAE
Рід Alfapolyomavirus – HPV-5,8,9,12,13, поліомавірус миші 1,…
Рід Betapolyomavirus – HPV-1-4, поліомавірус макаки-резус (SV40), ….
Рід Gammapolyomavirus – HPV-6,7,10,11,….
Рід Deltapolyomavirus - поліомавірус папуг 1, поломавірус сірої гуски, …
відносять поліомавірус зеленої мавпи, ВК поліомавірус, поліомавірус хом’яка, JC поліомавірус, поліомавірус KI, поліомавірус WU, вірус клітин Меркеля, вакуолізуючий вірус кролів, пневмотропний вірус мишей,, позатимусний поліовірус щурів та ін.

Морфологія
Капсид – ікосаедричний, 40-45 нм у діаметрі. Без зовнішньої ліпідовмісної оболонки.
Віріон складається із 72 капсомерів (VP1), які асиметрично розташовані.

Віріон SV40, T=7, побудований з 3-х білків. Кільцева 2л ДНК всередині знаходиться у комплексі із пістонами.
Організація геному компактна, транскрипція двонаправлена з ділянки ORI. Транскрипція ранніх Т-антигенів починається з матричних ланцюгів, а пізніх (структурних) – з нановосинтезованих.

Структура геному
Вірусний геном може бути розділений на 3 регіони. Один з яких кодує два функціональні білки: великий та малий Т–антигени, другий кодує три структурних білки, а третій, некодуючий, контролює транскрипцію вірусних генів.
Розмір геном приблизно однаковий для усіх представників родини, близько 5 тис. пар нт. (SV 4- штам 776 – 5243 kbр, ВК – 5153 kbр). ДНК займає приблизно 12-13 % загальної маси віріону.
Співвідношення G+C дорівнює 40-50%.
Геном - 1 молекула циркулярної 2-л ДНК.

Геном поліомавірусу миші

Внутрішній контролюючий регіон поліомавірусу миші

Геном
Кільцева 2л ДНК всередині знаходиться у комплексі із пістонами

Функції великого Т антигену (SV40)
in vitro та in vivo
Зв’язування з ДНК (специфічно з ділянкою початку реплікації);
Зв’язування з ДНК (з будь-якими ділянками);
Зв’язування з р53;
Активація пізніх стадій репродукціїі SV40;
Інгибція ранньої транскрипції SV40;
Індукція синтезу хазяйської ДНК в клітинах, що знаходяться в фазі G;
Діє як складова частина трансплацентарного пухлиноспецифічного антигену SV40;
Ініціація реплікації вірусної ДНК;
Встановлення та підтримання трансформації, що викликається SV40;
Стимуляція репродукції аденовірусів людини в культурі клітин мавп;
Супутні ферментативні активності:
АТФазна;
Кіназна (власна функція Т?);
Аденілювання Т-антигену (власна функція Т?).

Онкогенні властивості SV-40 та поліомавіруси миші

Ранні
T, mT (у поліомавірусів миші та хомяка), t,
Пізні
VP1- головний компонент, що формує гексони;
VP2, VP3 – формують пентони;
LP1 – агнопротеїн, підсилює збірку капсиду вірусу, він не є структурним компонентом зрілого віріону.
Також для деяких вірусів показана наявність додаткових альтернативних білків та існування ймовірних відкритих рамок зчитування (ELP, VP4).
Білки

Ліпіди та вуглеводи у складі віріону не виявлені.

Фізико-хімічні властивості
Маса віріонів 25 x 103 кДа. Щільність у градієнті сахарози та CsCl 1,2 та 1,34-1,35 г/см3, відповідно. SW20= 240S.
Стійки до ефіру та нагрівання (1 год при 50оС), хоча віріони нестабільні до нагрівання (1 год при 50оС)у присутності 1 М MgCl2.

Адсорбція
Вірус приєднується до поверхні чутливої клітини шляхом з’єднання VP1 з клітинним рецептором. Поліомавіруси (окрім SV 40, який для проникнення використовує МНС І) для адсорбції зв'язуються із залишками сіалової кислоти.

Цикл репродукції SV- 40
Проникнення віріону та звільнення серцевини (рецепторний ендоцитоз).
Проникнення комплексу ДНК/нуклеосома у ядро.
3-5. Синтез та альтернативний сплайсинг ранніх (Т) транскриптів; синтез білків.
6-7. Імпорт LT назад до ядра, де за його допомогою та при участі кл. ферментів відбувається ініціація синтезу та транскрипція пізніх генів.
8-12. Синтез мРНК пізніх генів, сплайсинг, експорт, трансляція та імпорт структурних білків до ядра для формування віріонів та звільнення (невідомий механізм, можливо за рахунок злиття мембран везикул та плазматичною мембраною).

Транскрипція
SV40
“Використовує” клітинну РНК-полімеразу II.
Ранні гени кодують T антигени, що утворюються з мРНК, які по-різному сплайсовані.
Пізні гени кодують VP1, VP2, VP3 та агнопротеїн (agnoprotein), які експресуються з двох мРНК, які по-різному сплайсовані.
VР2 та VP3 утворюються з однієї мРНК, використовуючи різні старт-кодони, агнопротеїн експресується з тієї ж мРНК, що і VP1, використовуючи різні старт-кодони.

SV40 virus

Сигнали поліаденілювання та перекриття 3-кінця
Сигнали поліаденілювання та перекриття 3-кінця

Реплікація
Починається через 12-15 годин після ураження клітини.
Напрямок – двонаправлений з ділянки origin.
Великий Т антиген - єдиний білок залучений у реплікацію ДНК.
Інші білки, задіяні у реплікацію – клітинні.
Пізніше у реплікативному циклі виявляються циркулярні молекули – реплікація відбувається за механізмом “ колеса, що котиться ”.

Малий T антиген
Малий Т стимулює мар-кіназну

Середній Т-антиген приєднується до с-Src та активує шлях, що стимулює клітинний метаболізм та клітинний поділ

EM реплікації ДНК SV40, двонаправлена реплікація
Схематичне зображення двонаправленої реплікації з єдиного сайту реплікації origin (Ori).

Continuous DNA synthesis from Ori, RNA primed (primase)5’>3’
Discontinuous DNA synthesis toward Ori, also RNA primed, also 5’>3” (Fig 9.2, Principles of Virology)
Напівконсерватиний синтез ДНК SV40:

Реплікація SV40
має АТФ-азну активність;
може функціонувати як ДНК хеліказа. Розкручує ДНК у ділянці Ori і дозволяє приєднуватися клітинному праймазному комплексу для ініціації двонаправленої реплікації ДНК. Ці події призводять до формування 2-л молекул, що набувають суперспіральної конформації за рахунок клітинної топоізомерази ІІ.
активатор активності клітинних генів, які залучені у контролювання клітинного циклу. При цьому відбувається індукція й синтезу клітинної ДНК. У кк відбувається іморталізація кл (клітини постійно діляться).
Великий Т антиген відіграє визначальну роль у реплікації

Пізні транскрипти
Пізні мРНК:
Транскрибуються після реплікації ДНК з ланцюгів, комплементарних ланцюгам, що слугують для транскрипції ранніх мРНК;
Транскрибуються з новосинтезованих, а не з батьківських геномів;
Транскрибуються у значно більших кількостях ніж ранні;
У них закодована інформація про три структурні білки, за рахунок різноманітного сплайсингу.

SV40
Переключення експресії ранніх на експресію пізніх генів відбувається після початку синтезу ДНК. Пізній промоторний регіон містить множинні сайти для клітинного репресору - Ibp. Після початку реплікації концентрація пізніх промоторів різко підвищується, і таким чином не всі сайти зв'язування з Ibp зайняті і ці промотори стають доступними для транскрипційних клітинних факторів. Великий Т антиген приєднується до промоторів і допомагає активувати транскрипцію пізніх генів і супресувати транскрипцію ранніх генів.

Механізми формування структурних одиниць віріонів

Формування субодиниць каписиду з індивідуальних білкових молекул
У поліомавірусів вірусні структурні білки потрапляють у середину ядра як попередньо зібрані структурні одиниці - пентамери [Py] (VP1 асоціюються з однією молекулою або VP2 або VP3).

Формування вірусних часток та вихід з клітини
Збірка:
Відбувається в ядрі;
Вірусний геном асоціюється з гістонами і інкапсидується у недозрілі частки;
Формування субодиниць капсиду з індивідуальних білкових молекул.
Вихід
за рахунок лізису кл.

Віруси мають чітко виражене коло хазяїв та розмножуються у певних КК. У непермісивних клітинах вірус може викликати трансформацію за рахунок активності ранніх генів.
Трансформація та онкогенні властивості поліомавірусів є результатом експресії вірусних ранніх генів та їх взаємодії із продуктами специфічних клітинних генів (p 53, pRB). У трансформованих клітинах та клітинах пухлин поліомавіруси знаходяться у стані провірусу – інтегрована ДНК.

Поліомавіруси розповсюджені по всьому світі. Вони часто призводять до розвитку персистентної інфекції.
SV-40 є лімфотропним вірусом приматів.
Відомо 13 поліомавірусів, що уражують людину. Чотири з них подібні до вірусу SV-40 (вірус JC, вірус BK, вірус KI и вірус WU), тому ураження цими вірусами складно відрізнити від інфекції, обумовленої SV40.
Поліомавірус клітин Меркеля значно відрізняється від інших поліомавірусів людини і є більш подібним до вірусів мишей.
Папіломавірус 6-го типу (HPV6) вірус має віддалену подібність до 5-го типу (HPV5).

Вірус JC уражує клітини дихальної системи, нирок та мозку.
Вірус ВК призводить до респіраторних інфекцій, та уражує нирки у пацієнтів зі зниженою функцією імунної системи, наприклад, після трансплантації органів.
Два поліомавіруси KI (Karolinska Institute) та WU (Washington University) близько споріднені та виділяються з секретів дихальних шляхів.
У 2008 році описаний поліомавірус клітин Меркеля, що викликає рак шкіри Меркеля.
У серпні 2010 описаний поліомавірус, що викликає триходисплазію (trichodysplasia spinulosa-associated polyomavirus).

Механізми передачі
1. Парентеральний;
2. Контактний;
3. Повітряно-крапельний;
4. Трансплацентарний.
Віруси розповсюджуються
за рахунок реактивації у організмі вагітних жінок,
за рахунок виділення невеликої кількості вірусу через сечу
та в результаті пересадки органів.
Передача також може здійснюватися під час контакту та повітряно-крапельним шляхом.

From Medical Microbiology, 5th ed., Murray, Rosenthal & Pfaller, Mosby Inc., 2005, Fig.52-8.
Патогенез
JC/BK
Проникнення у респіраторний тракт
Репродукція у клітинах РТ
Первинна вірусемія
Репродукція у клітинах нирок
Вторинна вірусемія
Імунокомпетентні особини
Латентна інфекція у нирках
Імунодефіцитні особини
Реактивація
ВК репродукується в клітинах сечового тракту
Вірусемія та ймовірно геморагічний цистит
Вірусемія JC
ЦНС
Ймовірний розвиток прогресуючої багатовогнищевої лейкоенцефалопатії

Антитіла до BKV виявляються у 90% дітей до 10 років.
Нефропатія, обумовлена BKV, в більшості випадків призводить до руйнування ниркового трансплантату.
Розповсюдження BKV за допомогою сечі превалює над розповсюдженням вірусу через кров під час вірусемії.
BKV уражує трубчасті епітеліальні клітини (decoy): клітини швидко (протягом хвилин) руйнуються, що може утруднювати мікроскопічне обстеження сечі.
BKV

Помилки в діагностуванні (негативні результати) завжди призводить до незворотної нефропатії.
Біопсія алотрансплантатів на наявність BKV є досить специфічною через неоднозначність ранньої інфекції та очевидні сумніви щодо наявності вірусу у медулярній тканині нирок.
BKV

JCV
Людський вірус JCV може викликати руйнування олігодендріоцитів ЦНС, викликаючи при цьому фатальну демієлінізаційну хворобу, яка називається прогресуюча мультифокальна (багатовогнищева) лейкоенцефалопатія.

JCV
JCV виявляється у сечі 30-70% дорослого населення, у 90% дорослого населення виявляються антитіла до JCV.
генотипи, які мають певне географічне поширення:
Тип 1 та тип 2 поширені відповідно в Європі та Азії, а типи 3 та 6, як правило, - в Африці. Тип 4, що є рекомбінантом європейського та азійського генотипів (1 та 3), поширений в США.

JCV
Ураження JCV відбувається в ранньому дитинстві ймовірно через респіраторний тракт. А потім розвивається персистентна інфекція у нирках, звідки вірус виділяється з сечею.
Захворювання розвивається на фоні імунодефіцитних станів: СНІД, лімфома, лейкемія, карцинома, саркоідоз, туберкульоз, фармакологічна імуносупресія (після трансплантації органів). У півкулях великого мозку, мозковому стовбурі та мозочку виявляються множинні вогнища та демієлінізації між білою та сірою речовиною. В основному уражуються олігодендроцити.
порушення вищих мозкових функцій та розлади свідомості з наступною грубою деменцією.

Поліомавірус з клітин Меркеля
є причиною однієї з найбільш небезпечних форм раку шкіри - раку з клітин Меркеля.
Вірус присутній в 80% пухлин цього типу.
Клітини Меркеля розташовуються в глибоких шарах епідермісу шкіри і вважаються відповідними за тактильну чутливість. Рак з клітин Меркеля є агресивною злоякісною пухлиною шкіри, що уражує переважно літніх людей і пацієнтів з ослабленим імунітетом, зокрема хворих на СНІД, а також реципієнтів органу.
Merkel cell carcinoma (arrow) infiltrating skin tissue, stained brown for Merkel cell polyomavirus large T protein

Діагностика
Для імуногістологічної діагностики звичайно застосовують анти-SV40 антитіла, які виявляють також ВК-вірус та JC-вірус.
Комерційні ДНК-зонди для діагностики методом гібридизації in situ ( виявляє наявність антигену або ДНК-вірусу лише в стадії, коли в біоптаті вже визначають інтрануклеарні включення).
Електронна мікроскопія біоптата трансплацентованої нирки дозволяє виявити інтрануклеарні вірусні частки, які, як правило, зустрічаються у вигляді кластерів.
Патогномонічними для ВК-вірусної інфекції є наявність у складі сечового осаду так званих "decoy"-cells.

Виявлення специфічних клітин у незабарвленій свіжозібраній сечі
(трубчасті епітеліальні клітини з ядерними включеннями, асоційованим з BKV)
Digital photographs courtesy of Mr. David Oliver and Mrs. Luana Kiandoli, Nephrology Laboratory, WRAMC

Тип I: аморфні включення типу “матове скло”
вигляд ядра -“матове скло”
400x (Olympus BH2 microscope)
Reference 7

Тип II: гранулярні включення, оточені “ореолом”
400x (Olympus BH2 microscope)
Reference 7

Тип III: дрібно гранулярні включення без ореалу
400x (Olympus BH2 microscope),
Enlarged 1.6x in processing image.
Reference 7

Тип II/III гібридний:
400x (Olympus BH2 microscope),
Enlarged 2x in processing image.
Внутрішньоклітинні
вакуолі
Reference 7

Тип IV: вaкуолеподібні включення із згрупованим, невпорядкованим хроматином
400x (Olympus BH2 microscope),
Enlarged 2x in processing image.
Reference 7

Альтернативним діагностичним методом є електронно-мікроскопичне дослідження негативно забарвлених осадків сечі
Диференційна діагностики включає виявлення регенерованих змін ядер канальцієвого епітелію, ЦМВ-, аденовірусної інфекції, просто герпесу, інфекції, зумовленої varicella zoster, каріомегаличного інтерстиціального нефриту.

Терапія інфекції, обумовленої вірусом ВК.
Основним підходом в лікуванні ВК-нефропатії є зниження імуносупресії. Можливо застосування внутрішньовенного імуноглобуліну (IVIG).
Показана можливість застосування препарату цидофовір (Cidofovir).
Застосування інших препаратів (vidarabin, ингибиторів топоізомерази, topotecan, campothecin) знаходиться на стадії розробки.
Профілактика – відсутня.

Екфективне лікування JCV-інфекції відсутнє. Призначають амантадин (мідантан) або цитозин, арабінозид, аденін арабінозид.