848856

Изобретение ПЦР
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR) изобрел в 1983 году американский ученый Кэри Мюллис (Kary Mullis).
Kary Mullis, Лауреат Нобелевской
премии 1993 г. по химии

Принципы технологии ПЦР
Мишень – генетический материал.
Метод прямого выявления возбудителя, основанный на универсальности способа хранения и передачи генетической информации.
Высокая чувствительность, основанная на принципе экспоненциального накопления продукта.
Высокая специфичность, основанная на выявлении уникальных последовательностей генома.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
ПЦР - это метод, имитирующий естественную репликацию ДНК и позволяющий обнаружить единственную специфическую молекулу ДНК в присутствии миллионов других молекул.

Компоненты реакции
Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:
ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.
Два праймера, комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК.
Термостабильная ДНК-полимераза — фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК.
Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ).
Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы.
Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции — рН, ионную силу раствора.

Принцип метода заключается в удвоении (амплификации) участка ДНК, ограниченного праймерами, при помощи фермента ДНК-полимеразы.
За каждый следующий цикл амплификации происходит удвоение как исходного участка ДНК, так и вновь синтезированных фрагментов (амплификатов).

В результате этого число фрагментов растет в геометрической прогрессии (цепная реакция). После 30 - 40 циклов их число превышает несколько миллиардов, что делает возможным их обнаружение различными методами.

Проблемы при использовании ПЦР в лабораторной диагностике
Высокий риск контаминации продуктами ПЦР
Субъективизм в интерпретации данных электрофореза и сложность автоматизации процесса
Отсутствие связи между начальной концентрацией ДНК и конечной концентрацией продукта

Необходимость в отдельных помещениях (зонах) для выделения НК, постановки ПЦР и проведения электрофореза.

Отсутствие стандартизации электрофоретичнского этапа ПЦР-анализа
Субъективное восприятие лаборантом «спорных» результатов.
Отсутсвие стандартных параметров при регистрации изображения с помощью трансиллюминаторов,видеосистем и др.

Субъективизм в интерпретации полученных данных, основанных на визуальном анализе электрофореграмм.

Расширение возможностей полимеразной цепной реакции – использование метода Real-time PCR (ПЦР с детекцией накопления продуктов амплификации в режиме реального времени)

ПЦР в реальном времени
Метод использует общие принципы ПЦР. Основное отличие состоит в том, что измеряется количество амплифицированной ДНК в реальном времени после каждого цикла амплификации.

Преимущества ПЦР в реальном времени:
все операции проводятся в одной пробирке;
- исключается риск контаминации ПЦР-смеси и продуктов;
быстрота анализа;
- возможность автоматизации;
- экономия затрат времени и труда.

Детекция накопления продуктов реакции (ампликонов) может измеряться двумя способами:
неспецифически, с помощью интеркалирующих флуоресцентных красителей (напр. SYBRGreen, SYBR Gold)
с помощью олигонуклеотидов с флуоресцентными метками (повышает специфичность реакции); этот способ используется чаще.

Для проведения анализа необходим специальный прибор - амплификатор для ПЦР в реальном времени, который совмещает в себе функции термоциклера и флуоресцентного детектора.

Метод выщепления флуорофора за счет разрушения зонда.
В этом случае в реакционной смеси должен присутствовать еще один компонент — специальный одноцепочечный ДНК-зонд: молекула ДНК, комплементарная последовательности амплифицируемого фрагмента, расположенной между праймерами. При этом к одному его концу должен быть химически приделан флуорофор (флуоресцирующая молекула), а к другому — гаситель (молекула, поглощающая энергию флуорофора и «гасящая» флуоресценцию). Когда такой зонд находится в растворе или комплементарно связан с целевой последовательностью, флуорофор и гаситель находятся относительно недалеко друг от друга, и флуоресценции не наблюдается. Однако за счет 3´-экзонуклеазной активности, которой обладает ДНК-полимераза (то есть она расщепляет ДНК, на которую «натыкается» в ходе синтеза, и на ее месте синтезирует новую), зонд при синтезе второй цепи разрушается, флуорофор и гаситель за счет диффузии удаляются друг от друга, и появляется флуоресценция.