Адаптивные свойства уропатогенных escherichia coli

ИМП
Второе место по распространенности среди заболеваний человека.
Диагностируются у людей обоих полов самого разного возраста, хотя чаще они встречаются у женщин.
Возраст, пол, сексуальная активность, период менопаузы, беременность и медицинские осложнения.
Чаще всего имеют бактериальную этиологию.
Escherichia coli.

Цель исследования
Изучить антибиотикорезистентность, адгезивную и пленкообразующую активности уропатогенных Escherichia coli.

Задачи исследования
1. Изучить видовой состав возбудителей, выделенных от больных с признаками ИМП, определить преобладающие виды и провести анализ частоты встречаемости возбудителей заболеваний в зависимости от пола и возраста пациентов.
2. Определить спектр чувствительности клинических штаммов условно-патогенных бактерий к антимикробным препаратам и наличие бета-лактамаз расширенного спектра (БЛРС) у клинических штаммов E. coli фенотипическим методом.
3. Выявить корреляцию установленной фенотипическими методами устойчивости к бета-лактамным и аминоглизидным антибиотикам уропатогенных E. coli с наличием генетических детерминант: плазмидных генов ctx-m и aac(3)-II.
4. Изучить влияние наличия гена fimH на адгезивные свойства и пленкообразующую способность клинических штаммов E. coli.
5. Исследовать структурные особенности моделей микробных биопленок
E. coli, сформированных на поверхности изделий медицинского назначения в условиях in vitro, штаммами, отличающимися по наличию гена fimH.

Основные положения, выносимые на защиту
E. coli являются преобладающими уропатогенами с наибольшим количеством изолятов.
Выделенные клинические штаммы возбудителей ИМП характеризуются множественной антибиотико-резистентностью.
Формирование устойчивости клинических штаммов E. coli к β-лактамным и аминогликозидным антибиотикам связано с наличием гена ctx-m, кодирующего синтез БЛРС и гена aac(3)-II, кодирующего аминогликозид-модифицирующие ферменты.
Наличие гена вирулентности fimH обуславливает высокую адгезивную активность клинических штаммов E. coli, а также обеспечивает активное формирование микробных биопленок на поверхности изделий меицинского назначения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Экспериментальные исследования в период с 2013 по 2016 гг. выполнены:
На кафедре микробиологии и физиологии растений Саратовского государственного университета имени Н.Г. Чернышевского;
На базе лаборатории молекулярной биологии Саратовского государственного университета имени Н.Г. Чернышевского;
На кафедре экологии Саратовского государственного технического университета имени Ю.А. Гагарина;
На базе научной биологической лаборатории и НОЦ «Промышленная экология» Саратовского государственного технического университета имени Ю.А. Гагарина
На кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии Саратовского государственного медицинского университета имени В.И. Разумовского.

Таблица 1 – Объекты исследования

Таблица 2 – Перечень использованных антимикробных препаратов

Таблица 3 – Характеристика ПЦР-праймеров для выявления генов ctx-m, aac(3)-II и fimH уропатогенных кишечных палочек

Таблица 4 – Этапы амплификации с помощью ПЦР для определения генетических маркеров

Определение адгезивной способности
Метод В. И. Брилис и соавт. (1986) и
С. С. Гизатулиной и соавт. (1991).
0,5 мл взвеси исследуемых бактерий в концентрации 10 млрд. м.к./мл.
суспензия эритроцитов человека 0(I) Rh+ группы крови в концентрации 100 млн. кл/мл.
инкубация при встряхивании на шейкере при температуре 37°С в течение 30 минут.
мазки фиксировали смесью Никифорова, окрашивали по методу Грама и исследовали в иммерсионной системе микроскопа.

Формирование микробных биопленок
Процесс моделировали в условиях in vitro в лунках иммунологических планшетов (Тец В. В., 2006).
Суспензия суточных культур бактерий в физиологическом растворе по стандарту мутности 0,5 по МакФарланду.
В лунки планшета вносили по 200 мкл мясо-пептонного бульона и суспензии микроорганизмов с концентрацией микробных клеток 100 тыс. КОЕ/мл.
Инкубировали в течение 24 часов при температуре 37°С.
Планктонные формы бактерий удаляли, лунки троекратно промывали физиологическим раствором и вносили на 10 минут 1%-ый водный раствор красителя кристаллического фиолетового.
Лунки отмывали, связавшийся с биопленками краситель растворяли в ацетон-этиловой смеси.
Количественный учет пленкообразования штаммами исследуемых микроорганизмов оценивали на спектрофотометре для микропланшет Epoch (Биотек, США) по величине связывания ими кристаллического фиолетового (ед. ОП).
Исследование динамики формирования микробных биопленок в условиях in vitro проводилась в течение 96 часов.

Электронная микроскопия
Использовали электронный микроскоп Aspex Explorer.
Микроскопию проводили при ускоряющем напряжении 20 kV, ток эмиссии – 50 μА. Изображение получали во вторичных электронах.

Таблица 5 – Видовой состав микроорганизмов, выделенных
от больных с признаками инфекций мочевыводящих путей

Рисунок 1 – Выявление возбудителей ИМП в разных возрастных группах

Рисунок 2 – Частота встречаемости инфекций мочевыводящих путей у мужчин и женщин

Рисунок 3 – Чувствительность условно-патогенных бактерий, выделенных при ИМП,
к антимикробным препаратам

Таблица 6 - Показатели чувствительности выделенных условно-патогенных бактерий к антимикробных препаратам
* Количество антибиотиков, к которым чувствительны или устойчивы выделенные штаммы.

Таблица 7 – Частота индикации E. coli, продуцирующих БЛРС
БЛРС

Рисунок 4 - Результаты определения гена устойчивости ctx-m у штаммов E. coli
51,4%

Рисунок 5 - Результаты ПЦР-анализа образцов ДНК штаммов E. coli на наличие гена ctx-m

Рисунок 6 - Результаты определения гена устойчивости aac(3)-II у штаммов E. coli
Штаммы E. coli, чувствительные к TOB и GM.
Штаммы E. coli, устойчивые к TOB и GM.
Штаммы E. coli, имеющие ген aac(3)-II
20,7 %

Рисунок 7 - Результаты ПЦР-анализа образцов ДНК штаммов E. coli на наличие гена aac(3)-II

Рисунок 8 - Результаты определения гена fimH у
штаммов E. coli

Рисунок 9 -Результаты ПЦР-анализа образцов ДНК штаммов E. coli на наличие гена fimH

Таблица 8 – Значения индекса адгезии микро-организмов стандартного и клинических штаммов исследуемых бактерий

Таблица 9 – Динамика величин связывания кристаллического фиолетового микробными биопленками, образованными стандартным и клиническим штаммами E. coli

Рисунок 10 – Электронная микрофотография микробной биопленки клинических штаммов E. coli: А – E. coli № 3 (fimH-), Б – E. coli № 92 (fimH+)
А
Б

ВЫВОДЫ
1. Из выделенных 200 штаммов бактерий-возбудителей ИМП 92,5% являлись представителями семейства Enterobacteriaceae, из которых 55,5% были уропатогенные E. coli, 14% Klebsiella spp., 11.5% Enterobacter spp., 10% Proteus spp. 1,5% M. morganii. Уропатогенные бактерии выделялись с большей частотой у возрастной группы 27-36 лет (27,5%), а ИМП регистрировались чаще у женщин (57,5%).
2. Большинство (59,3%) выделенных штаммов уропатогенных бактерий характеризовались высоким уровнем устойчивости к антибиотикам и антимикробным химиотерапевтическим препаратам, однако все были чувствительны к IPM и AK. Методом «двойных дисков» доказано наличие БЛРС у 51,4% клинических штаммов уропатогенных E. coli.
3. Оценка генетических детерминант устойчивости бактерий с использованием ПЦР позволила установить наличие гена ctx-m у 64,9% штаммов E. coli, для которых предварительно было установлено наличие БЛРС фенотипическим методом, и гена aac(3)-II, кодирующего ацетилтрансферазу, у 78,2% исследуемых штаммов уропатогенных E. coli, для которых была установлена устойчивость к TOB и GM.

ВЫВОДЫ
4. Доказано наличие гена fimH, детерминирующего синтез пилей-1 типа, у 70% штаммов уропатогенных E. coli. Впервые установлена взаимосвязь наличия данного гена с увеличением адгезивной активности уропатогенных E. coli, которые по показателям индекса адгезии микроорганизмов характеризовались как высокоадгезивные (от 4,28 до 7,22).
5. Наличие гена fimH обеспечивает уропатогенным E. coli более интенсивный процесс формирования микробных биопленок на инертных поверхностях лунок иммунологических планшетов и образцах полиуретановых уретральных катетеров по сравнению со стандартным штаммом E. coli АТСС 25922 и клиническими штаммами, не имеющими данного гена.