Анализ хромосом человека. Культивирование лимфоцитов периферической крови и приготовление препаратов метафазных хромосом

Методы получения препаратов хромосом
Прямые: клетки делятся
in vivo
Непрямые:
клетки делятся
in vitro
костный мозг
селезенка
семенник
кишечный эпителий
соединительная ткань
хорион (плацента)
лимфоциты периферической крови
амниоциты
фибробласты кожи

Методы получения препаратов хромосом

Культивирование лимфоцитов периферической крови
Требования к биологическому материалу:
Использование антикоагулянта (гепарина)
Стерильность
Культура лимфоцитов:
Кратковременная (72 ч)
Митоген (ФГА)
Цитостатик (колхицин)
Гипотоническая обработка клеток
Фиксация клеток
Приготовление
препаратов

Оборудование
Помещение для работы в стерильных условиях, оснащенное ламинарным боксом;
Лабораторная комната, оснащенная вытяжным шкафом;
Термостат или СО2-инкубатор;
Холодильник;
Весы аналитические;
Центрифуга;
Микроскоп, оснащенный фазовым контрастом

Расходные материалы и реактивы
Стерильные флаконы или пробирки для культивирования клеток
Комплект дозаторов и стерильные наконечники на разные объемы
Одноразовые шприцы (1-2 мл, 10 мл, 20 мл) при необходимости
Стерильные флаконы для смешивания среды для культивирования клеток
Штативы для пробирок
Пинцеты, ножницы, маркеры
Спиртовка, зажигалка
Центрифужные конические пробирки
Ватные или марлевые тампоны, стерильные перчатки
Спирт этиловый (70⁰) для обеззараживания поверхностей и инструментария
Питательная среда для культивирования клеток
Сыворотка крови эмбрионов коров
Антибиотики
Митоген
L-глутамин
Калий хлористый
Спирт этиловый (95⁰) для приготовления фиксатора для клеток
Ледяная уксусная кислота для приготовления фиксатора для клеток
Флаконы для приготовления гипотонического раствора и фиксатора
Предметные стекла
Стакан для стекол

Реактивы для культивирования клеток
Питательная среда (Игла MEM, 199, RPMI 1640, Ham F-12 и др.)
Для разных типов клеток предпочтительны разные среды.
Питательная среда для культивирования содержит почти все (или необходимые) аминокислоты, витамины, некоторые предшественники нуклеиновых кислот, соли, источники липидов и углеводов и другие компоненты. Модификации сред определяются составом и количеством компонентов.
рН среды – 7,2 – 7,4. Для контроля рН в среды добавляют цветной индикатор (фенол-фталеин).
Газовая среда при культивировании – воздух или СО2 (5%).

Реактивы для культивирования клеток
Сыворотка (крови коров, крови плодов коров)
Обеспечение гормональными факторами, стимулирующими рост клеток и их функции. Факторы роста (несколько нг/мл) могут быть специфическими и неспецифическими, действуют как митогены. Гормоны (инсулин, глюкокортикоиды, эстрогены, андрогены)
Обеспечение факторами прикрепления и распластывания клеток (создание биоматрикса) – фибронектин, коллаген.
Обеспечение транспортными белками, переносящими гормоны, (альбумин, трансферрин), минеральными веществами (Cu, Zn, Co, Mn, Mo, Va, Se - выполняют разные функции, в том числе активация ферментов), липидами (простагландины, холестерин, линолевая кислота) и т.д.
Недостатки:
не для всех клеток это физиологическая среда, возможна цитотоксичность
изменчивость свойств сыворотки в зависимости от партии препарата
может не содержать достаточного количества ростовых факторов

Реактивы для культивирования клеток
Антибиотики (пенициллин, стрептомицин, гентамицин)
Предохраняют среду от заражения микроорганизмами.
Недостатки:
нестойкость в растворе пенициллина и стрептомицина
токсичность в эффективных концентрациях

Методы культивирования
Макрометод: используют плазму с лимфоцитами
4 – 8 мл среды для культивирования
Полумикрометод:
0,5 мл цельной крови
6 мл среды для культивирования
1 – 1,5 мл сыворотки
Микрометод:
˂0,5 мл цельной крови (0,2)
2 мл среды для культивирования
0,75-1 мл сыворотки
Наша модификация:
9 мл среды для культивирования
1 мл эмбриональной сыворотки крс
0,75 мл цельной крови
25-50 мкг/мл гентамицина
L-глутамин
12 мкг/мл ФГА (120 мкл раствора 1мг/мл)
Условия культивирования:
в термостате при 37⁰С в течение 72 часов в герметично закрытых флаконах

Накопление клеток на стадии метафазы с помощью цитостатиков
Колхицин (колцемид) - алкалоид из растений рода Colchicum, препятствует сборке нитей веретена деления, и как следствие приводит к «аресту» делящейся клетки на стадии метафазы.
Концентрации колхицина – 0,4 – 8 мкг/мл, время инкубации клеток 40-60 мин. Время обработки важнее концентрации. «К-митозы»
Наша модификация:
Из раствора колхицина (1мг/мл) взять 70 мкл и добавить в культуру клеток (в пробу 10 мл, конечная концентрация 7 мкг/мл). Инкубировать в течение последних 35-40 мин культивирования.

Гипотоническая обработка клеток
Цель обработки клеток гипотоническим раствором – получение метафазных пластинок с наименьшим числом налеганий отдельных хромосом друг на друга.
В качестве таких растворов могут быть использованы водные растворы солей (KCl, цитрат Na), смесь сыворотки крови с водой.
В процессе гипотонической обработки происходит набухание клетки, разжижение цитоплазмы, нарушение межхромосомных связей.
Наша модификация:
По окончании времени культивирования содержимое флакона перелить в центрифужную пробирку и центрифугировать при 1000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость удалить, осадок хорошо встряхнуть и залить гипотониче-ским раствором (5 мл 0,56% водного раствора KCl). Время гипотонической обработки 25 мин при комнатной температуре.

Фиксация клеток
При фиксации клетки происходит:
коагуляция клеточных компонентов без разрушения внутренней структуры; затвердение коагулированной массы; протравливание клетки, дающее возможность её последующего окрашивания.
В качестве фиксирующего раствора часто используется смесь спирта (этанола или метанола) с ледяной уксусной кислотой в соотношении 3:1 (фиксатор Карнуа). Уксусная кислота быстро проникает в клетки и вызывает коагуляцию, спирт уплотняет клеточные компоненты. При фиксации клеток в суспензии разрушается клеточная оболочка лимфоцита, сохраняется структура хромосом и интерфазных ядер. Фиксацией удаляются обломки клеток и кислоторастворимые белки.
Наша модификация: По окончании времени гипотонии в пробирку добавить 0,5 мл свежеприготовленного охлажденного фиксатора Карнуа, пробирку закрыть крышкой и содержимое перемешать переворотом. Этот этап является префиксацией, которая позволит избежать последующего «створаживания» клеточной массы при фиксации. Пробирку центрифугировать (1000 об/мин, 6-10 мин), надосадочную жидкость удалить, осадок тщательно перемешать и добавить 5 мл охлажденного (+4-0⁰С) фиксатора. Пробирку поместить в холодильник (+4⁰С) на 20 мин. Провести еще две смены фиксатора. На этапе фиксации клетки могут храниться продолжительное время при температуре -20 ⁰С.