Familia Enterobacteriaceae. Microbiologia si diagnosticul de laborator al dizenteriei bacteriene

FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE
Peste 50 de genuri cu peste 250 specii
Habitat: intestinul omului, animalelor. Pot fi intalnite pe sol, plante, in apa, etc
Majoritatea fac parte din microflora normală (comensală) intestinală
Martori de contaminare fecală a mediului

CLASIFICAREA
ÎN FUNCŢIE DE PATOGENITATE:
Enterobacteriaceae patogene: genurile Shigella, Salmonella, unele specii ale genurilor Yersinia şi Klebsiella (Yersinia pestis, Klebsiella pneumoniae), unele variante ale speciei Escherichia coli;
Enterobacteriaceae condiţionat patogene: genurile Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, Morganella, Proteus, Providencia, Serratia, Edwardsiella, etc.

Prezintă interes diagnostic diferențierea enterobacteriaceelor în 2 grupe:
Enterobacteriaceae lactozo-pozitive – Escherichia și alte genuri condiționat-patogene
Enterobacteriaceae lactozo-negative – Salmonella, Shigella, Yersinia (patogene)

TESTE-CHEIE ALE FAMILIEI ENTEROBACTERIACEAE
Bacterii (bastonaşe) gramnegative
Nesporogene
Mobile-peritriche sau imobile
Facultativ-anaerobe
Fermentează glucoza până la acid (A) sau acid și gaz (AG)
Catalazo-pozitive
Oxidazo-negative
Reduc nitraţii în nitriţi

TESTE PRIMARE (identificarea genurilor)
Utilizarea citratului de Na (mediul Simmons)
Utilizarea malonatului de Na
Hidroliza ureei (testul Preus)
Decarboxilarea lizinei (LDC)
Dezaminarea fenilalaninei (FAD) cu formare de acid fenilpiruvic
Producere de H2S în mediul multitest (ex.: Kligler)
Fermentarea glucozei până la acizi (testul MR - metil rosu)
Fermentarea glucozei până la acetoină / acetilmeticarbinol (testul VP – Voges Proskauer)
Mobilitatea (în geloză semilichidă)

TESTE SECUNDARE
(identificarea speciilor/variantelor)
Teste biochimice (fermentarea glucidelor, decarboxilarea aminoacizilor (arginină, ornitină), producerea indolului, etc)
Fagoidentificarea şi lizotipia
Seroidentificarea
Antibiograma
Colicinogenotipia

CARACTERE MORFOBIOLOGICE
ale bacteriilor din familia Enterobacteriaceae
Caractere morfologice: bastonaşe G-,
1 - 6 µm x 0,3 - 1 µm, mobile peritriche (Shigella, Klebsiella, Yersinia pestis – imobile), nesporogene, formează microcapsule (Klebsiella – capsulată), posedă fimbrii.

Caractere de cultură:
Facultativ anaerobe
Temperatura optimă 37 grade C (limite 18 – 45 grade)
Nepretenţioase nutritiv
Colonii S, apar după 18-24 h de incubare, 2 - 3 mm (după repicări pot apare colonii R), Klebsiella – colonii M (mucoide), Proteus – invadează suprafaţa mediului

MEDII DE CULTURĂ
De transport: glicerină 30%, soluţie salină 3%, soluţie tampon-fosfat
De îmbogăţire a bacteriilor patogene: Kauffman, Muller, bulion selenit, etc
Diferenţial-diagnostice:
De izolare a culturii pure
- Mediile ENDO, LEVIN, PLOSKIREV, SS, MacConkey
Compoziţia: bază nutritivă, lactoză, indicator
Coloniile L+ : colorate; Coloniile L- : incolore (frecvent flora patogenă)
- Mediul Wilson-Blair cu sulfit de Bi (Salmonella reduce sulfitul în sulfură de Bi – colonii negre pe mediul verde)

II. De acumulare şi identificare preliminară
(medii multitest)
Kligler (glucoză, lactoză, săruri de Fe, indicator)
Olkeniţki (glucoză, lactoză, zaharoză, uree, săruri de Fe, indicator)

III. De identificare finală (medii cu citrat de Na, malonat de Na, şirul Hiss, medii cu aminoacizi, gelatina, etc)

CARACTERE ANTIGENICE
Ag O, de perete, LPZ, termostabil şi rezistent la alcool, sensibil la formol.
Ag H, flagelar, proteic, termolabil şi inactivat de alcool, rezistent la formol.
Ag K, superficial, capsular, termovariabil. Maschează Ag O, determina inaglutinabilitate cu seruri anti-O. Variante – L, A, B la E.coli, Vi – la Salmonella şi Citrobacter
Ag F, fimbrial, termolabil, nespecific
ECA – (Enterobacterial Common Antigen) - antigen polizaharidic din peretele celular, comun familiei Enterobacteriaceae (interes taxonomic) – Ag Kunin
Antigenele O, K, H pot manifesta specificitate de gen, specie, grup, variantă/tip

GENUL SHIGELLA. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL DIZENTERIEI
Shigelele – strict umane. Cauzează infecţii intestinale - şigeloze, cea mai gravă formă–dizenteria bacteriană.
80-165 mln cazuri anual, 75 -600 mii de decese
Clasificarea genului Shigella (biochimică şi antigenică):
A – Shigella dysenteriae (15 s/v, 12 b/v) Manitol -
B – Shigella flexneri (6 s/v, 14 ss/v, 23 b/v)
C – Shigella boydii (23 s/v)
D – Shigella sonnei (1 s/v, 7 b/v)
Serogrupele B, C, D sunt manitol +
Descoperite in 1898 de Kiyoshi Shiga

CARACTERE MORFOBIOLOGICE
Enterobacteriaceea tipice, imobile, lactozo-negative (colonii incolore pe medii DD)
Teste primare - scindează glucoza pana la acizi (testul MR+), celelalte teste primare sunt negative.

FACTORI DE PATOGENITATE
Factori de adeziune la mucoasa colonului (fimbrii, LPZ)
Sistem de secretie tipul III (“seringa”)
Microcapsula (antifagocitar)
Factori de penetrare şi multiplicare intracelulară
Toxine:
Toxina Shiga, de origine cromosomială, elaborată de S.dysenteriae 1. Inhiba sinteza proteinelor in celula gazda. Manifesta activitate citotoxică (neurotoxică, enterotoxică, etc).
Citotoxine (Shiga-like toxine (SLT), verotoxine), codificate de bacteriofagi. Efect similar cu cel al toxinei Shiga.
Endotoxina

Structura antigenică: Ag O şi K cu specificitate de gen, specie, subspecie, variantă
Rezistenţa în mediul extern:
S.dysenteriae - foarte sensibilă (1-2 ore)
S.flexneri – persistă 1-3 săptămâni în apă, 2 luni în lactate
S.sonnei – persistă şi se multiplică în lactate

PATOGENEZA DIZENTERIEI BACTERIENE
Sursa de infecţie: bolnav, reconvalescent, purtător
Transmiterea fecal-orală:
Alimentar (alimente, apă)
Contact direct (mâini murdare)
Doza infectantă: 10-102 bacterii
Bacteriile afecteaza intestinul gros. Celulele epiteliale normale sunt rezistente la infectia cu Shigella spp.

In faza initiala Shigella este captata de celulele M din placile Peyer. Dupa transcitoza epiteliului intestinal bacteria este eliberata intr-o vacuola care ulterior este captata de macrofage. Shigella evita distrugerea prin initierea rapida a apoptozei macrofagelor, determinand eliminarea citokinelor proinflamatoare (IL1, IL18).
Shigella eliberata din macrofage invadeaza celulele epiteliale prin membrana bazo-laterala (macropinocitoză dirijată, asigurată de un grup de proteine – Ipa (invadind plasmid antigens), injectate prin sistemul de secretie III), ulterior produce liza membranei vacuolei si se multiplica in citoplasma enterocitelor.

Bacteriile se multiplică şi se propagă intra- şi intercelular graţie polimerizării actinei la un pol al celulei (caracter determinat plasmidic) cauzând distrugerea enterocitelor, ulceraţii.
Citokinele eliberate de macrofage si celulele epiteliale determina o recrutare masiva a PMN un locul infectiei, ceea ce duce la distrugerea integritatii epiteliului si facilita invazia directa a submucoasei, evitand celulele M. Astfel, moartea macrofagelor, distrugerea stratului epitelial, influxul masiv al PMN determina inflamaţia fibrinoasă intensă a colonului, micro-abcese şi ulceraţii, cu apariţia mucusului, puroiului şi sângelui în materiile fecale.

Perioada de incubaţie – 2 - 4 zile
Semne clinice – febră, dureri abdominale, tenesme (spasme rectale), scaune lichide mucopurulente-sanguinolente frecvente.
Vindecarea în 2-5 zile (clinică, apoi microbiologică).
Forme cronice sau portaj sunt posibile.

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL DIZENTERIEI
Prelevate: probe de scaun (elementele muco-sangvinolente, purulente), apa, alimente, lavaje de pe suprafeţe
Metode de diagnostic
Examenul microscopic – RIF
Examenul bacteriologic
I. Izolarea culturii pure pe medii DD (Endo, Levin, Ploskirev, SS) sau Îmbogăţirea shigelelor în bulion selenit

II. Coloniile lactozo-negative sunt repicate pe mediile Olkeniţki, Kligler pentru acumularea culturii pure şi identificare preliminară
(lactoza/zaharoza -, glucoza A, H2S -)
III. Identificarea definitivă a culturii pure
- Caractere morfotinctoriale
Caractere de cultură
Caractere biochimice (teste primare, secundare)
Caractere antigenice (seroidentificarea prin RA pe lamă cu seruri imune anti-Shigella poli- şi monovalente)
Fagoidentificarea
Antibiograma
IV. Analiza rezultatelor şi formularea răspunsului