Иммуноферментный анализ (ИФА)

ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ (ИФА).
Лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных низкомолекулярных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакция антиген-антитело. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для регистрации сигнала. Теоретические основы ИФА опираются на современную иммунохимию и химическую энзимологию, знание физико-химических закономерностей реакции антиген-антитело, а также на основные принципы аналитической химии.

ГЕТЕРОГЕННЫЙ ИФА В МИКРОПЛАНШЕТНОМ ФОРМАТЕ.
96-луночный микропланшет, используемый для ИФА.
Для осуществления анализа эффективности комплексообразования необходимо провести полную очистку комплексов от свободных компонентов. Эту задачу оказалось легко решить, если один из компонентов пары антиген-антитело прочно связать (иммобилизировать) на твёрдом носителе. Иммобилизация позволяет предотвратить агрегацию в растворе и осуществить физическое разделение образующихся комплексов от свободных компонентов. Использование иммобилизации антител на твёрдом носителе положило начало методам твердофазного (гетерогенного) ИФА.
Особую значимость для широкого внедрения твердофазного ИФА в практику имела разработка в качестве носителей для сорбционной иммобилизации антител и антигенов специальных полистирольных плат, содержащих 96 лунок. Введение полистирольных плат в практику ИФА позволило значительно увеличить число проводимых анализов и упростить методическую процедуру его выполнения. Были сконструированы специальные приборы, позволяющие автоматизировать стадии добавления реагентов, промывки и осуществлять одновременную регистрацию каталитической активности фермента-метки в каждой из лунок планшеты.
В ходе специфической реакции иммуносорбента с определяемыми в исследуемом образце антителами или антигенами образуются иммунные комплексы, которые оказываются фиксированными на твёрдой фазе. Субстанции, не участвовавшие в реакции, а также избытки реагентов, удаляются при многократной промывке. Такая схема позволяет упростить процесс эффективного разделения компонентов реакции.

ПРЯМОЙ ИФА.
разноцветные круги —антигены.
Y с лиловой точкой — антитела.
Биологический материал (кровь, соскобы со слизистых, мазки) помещается в чистые лунки на некоторое время (обычно 15—30 минут), достаточное, чтобы антигены могли приклеиться к поверхности лунок.
Далее в лунки добавляют антитела к выявляемому антигену. Это значит, что выявляя антигены, например, сифилиса, добавляются антитела против антигенов сифилиса. Данную смесь исследуемого материала и антител оставляют на некоторое время (от 30 минут до 4—5 часов), чтобы антитела смогли найти и связаться со «своим» антигеном. Для того чтобы убрать «лишние» антитела, содержимое из лунок выливают (или вымывают методом декантации). В результате этого все «лишние» антитела убираются, а остаются те, которые связались с антигенами, поскольку антигены «приклеены» к поверхности лунок.
Следующий этап — ферментативная реакция. В промытые лунки добавляют раствор с ферментом и оставляют на 30—60 минут. Данный фермент имеет сродство к веществу (специфической метке), с которым связаны антитела. Фермент проводит реакцию, в результате которой эта специфическая метка (субстрат) превращается в окрашенное вещество (продукт).

НЕПРЯМОЙ ИФА.
В непрямом иммуноферментном анализе используют антитела к выявляемому антигену, соединенные со специфической меткой. Эта специфическая метка и есть субстрат ферментативной реакции.
По типу иммунохимического взаимодействия на первой стадии анализа (в которой происходит связывание определяемого вещества) среди гетерогенных методов различают неконкурентный и конкурентный.

НЕПРЯМОЙ НЕКОНКУРЕНТНЫЙ ИФА.
синие круги — антиген.
Y, Y, Y, Y — антитела из внесённой в лунку сыворотки.
Y с лиловой точкой — антитела, меченные ферментом, обеспечивающим цветовую реакцию (конъюгат).
В лунки, на твёрдой поверхности которых предварительно сорбирован антиген, вносится исследуемый биологический материал (чаще всего сыворотка или плазма крови человека), содержащий антитела к антигену. Образец исследуется на содержание антител.
Исследуемые антитела из внесённого образца биологического материала во время инкубации связываются с антигеном и таким образом иммобилизируются на поверхности лунки. Несвязавшиеся антитела удаляют отмыванием.
В лунку вносят конъюгат, то есть антитело с заранее прикреплённым к нему ферментом (например, пероксидазой хрена, способное связаться с антителом, иммобилизированном на первой стадии. Если в ячейке имеются образовавшиеся на первой стадии иммунные комплексы, то конъюгат соединяется с ними во время второй инкубации, а несвязавшийся конъюгат удаляется последующим отмыванием.
Далее в лунку добавляется субстратно-хромогенный реагент, который превращается в окрашенный продукт под влиянием ферментного компонента конъюгата.
Отличие от прямого метода состоит в том, что исследуемые антитела не приклеиваются к поверхности чистой лунки, а связываются с иммобилизированным на планшете антигеном.

«СЭНДВИЧ».
разноцветные круги — различные антигены из внесённой в лунку сыворотки;
Y — антитела, иммобилизированные на поверхности лунки;
Y с лиловой точкой — антитела, меченные ферментом.
К носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген. В процессе инкубации на первой стадии на твердой фазе образуется комплекс антиген-антитело.
Затем носитель отмывают от несвязавшихся компонентов и добавляют меченные ферментом специфические антитела.
После вторичной инкубации и удаления избытка конъюгата антител с ферментом определяют ферментативную активность носителя, которая пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена. Ферментативная реакция (цветная реакция) проходит в присутствии перекиси водорода и субстрата, представленного неокрашенным соединением, которое в процессе пероксидазной реакции окисляется до окрашенного продукта реакции на заключительном этапе проведения исследования. Интенсивность окрашивания зависит от количества выявленных специфических антител.
На стадии выявления специфического иммунокомплекса антиген оказывается как бы зажатым между молекулами иммобилизованных и меченных антител, что послужило поводом для широкого распространения названия «сэндвич»-метод.

КОНКУРЕНТНЫЕ.
Прямой конкурентный ИФА.
Прямой конкурентный формат ИФА использует иммобилизованые на твердой фазе специфические антигены, а меченые ферментом и немеченые антитела конкурируют за связь с иммобилизованным антигеном.
Непрямой конкурентный ИФА.
В непрямом конкурентном формате ИФА используются меченные ферментом антивидовые антитела (специфические или вторичные) и иммобилизованный на твердой фазе конъюгат антиген-белок-носитель.

ГОМОГЕННЫЙ ИФА.
В 1972 г Рубеншетейн с сотрудниками разработали новый подход с проведением всего анализа без твёрдой фазы. Метод получил название гомогенного ИФА и был основан на учёте различий каталитических свойств ферментной метки в свободном виде и в иммунохимическом комплексе. Суть его состоит в связывании низкомолекулярного антигена с ферментом лизоцимом вблизи активного центра. В комплексе с антителами активный центр фермента становится стерически недоступен макромолекулярному субстрату, которым являются стенки бактериальных клеток. При увеличении концентрации определяемого антигена концентрация неактивного комплекса конъюгата с антителами снижается, а следовательно, возрастает регистрируемый параметр ферментативной реакции. На основе данного подхода были разработаны наборы для определения широкого круга токсических, наркотических и лекарственных средств. Существенным достоинством EMIT-анализа являются возможность использования малых объёмов анализируемого образца (5-50 мкл) и высокая скорость определения (2—5 мин), обусловленная отсутствием стадии разделения свободного и меченого анализируемого соединения. К недостаткам метода следует отнести меньшую чувствительность, чем в гетерогенном ИФА (~ 1 мкг/мл), и возможность определения только низкомолекулярных антигенов.