Лекция 7. Плазмодесмы. И вместе, и по отдельности…

Что и у кого?
Плазмодесмы – микроскопические каналы, пронизывающие клеточную стенку и обеспечивающие межклеточную коммуникацию.
У кого есть плазмодесмы?
Высшие растения (land plants or embryophytes) + Водоросли:
Класс: Charophyceae
Порядки: Charales (Харовые), Coleochaetales (Колеохетовые)

Первичные – формируются между сестринскими клетками, развиваются из канальцев в фрагмопласте во время цитокинеза.
Вторичные – формируются между соседними клетками, развиваются в результате ферментативной деградации материала клеточной стенки, срединной пластинки, слияния плазмалеммы соседних клеток и развития десмотрубочки в цитоплазматическом канале плазмодесмы.
По происхождению плазмодесмы делятся на:

Ультраструктура плазмодесм
Спицеобразные линкерные белковые структуры (миозин + актин) разделяют цитоплазматическое кольцо на микроканалы. По ним идет диффузия ионов, небольших органических метаболитов (АК, сахара), возможно, гормонов.

Плазмалемма, выстилающая плазмодесму, и мембрана ЭПР десмотрубочки отличаются по своим физико-химическим параметрам от плазмалеммы, подстилающей клеточную стенку, и мембраны кортикального ЭПР, соответственно. На этом основании вводятся термины:
PDom (outer membrane) – участок плазмалеммы, выстилающей плазмодесму;
PDim (inner membrane) – участок мембраны ЭПР десмотрубочки (сжатый ЭПР = appressed ER)

Характеристики плазмодесм
Плотность (= N плазмодесм / S поверхности КС)
Пространственное распределение плазмодесм на поверхности клетки (в ткани / органе) растения
- Показатели наличия и интенсивности транспортных межклеточных потоков, используются во многих физиологических исследованиях (напр.: загрузка/разгрузка ассимилятов в системе дальнего транспорта, поглощение и транспорт по растению элементов минерального питания)
SEL (size exclusion limit, kDa) – максимальная масса молекул, способных проникать через плазмодесму - не является постоянной величиной: 700 -1000 Da ~ 1.5 - 2.0 nm.

Структура и работа плазмодесм

Надклеточная организация тела высших растений («supracellular organisms»)
Апопласт – непрерывный континуум клеточных стенок, межклеточных пластинок и межклетников
Симпласт – общеорганизменная система сообщающихся через плазмодесмы протопластов клеток
Эндопласт – межклеточный континуум эндоплазматических сетей
«Клетка» высших растений представляет собой в большинстве случаев не полностью изолированный компартмент тела, включающий участки общеорганизменных систем: апопласта, симпласта (+эндопласта)
В теле растения существуют изолированные клетки/ группы клеток (напр.: замыкающие клетки устьиц )

Через плазмодесмы возможен межклеточный транспорт растительных и вирусных белков
Использование радиоактивной метки –
35S-метионин (при введении в лист метка была зарегистрирована как в клетках-спутницах, так и в безъядерных ситовидных элементах)
Проверяли гипотезу, что белки, синтезированные в клетках-спутницах, транспортируются в ситовидные элементы
Транспорт белков в безъядерные членики ситовидных трубок необходим для поддержания их функциональной активности

Плазмодесмы между клетками-спутницами и ситовидными элементами - точки интенсивного транспорта веществ
Для исследования белкового состава флоэмного экссудата необходимо получить его образцы. Метод –использование стилетов тлей!
Микроинъекции отдельных белков, полученных при фракционировании флоэмного экссудата (PP1, PP2, Ubiquitin), и белков, полученных в культуре клеток E. coli, вызывают увеличение SEL, и наблюдается транспорт этих белков в соседние клетки.

Симпластическая загрузка флоэмы
Сосуд ксилемы
Промежуточная клетка-спутница
(Intermediary Cell)
Плазмодесмы, контактирующие
с мезофиллом
Ситовидный элемент флоэмы
Промежуточные клетки-спутницы
Обильные плазмодесменные поля
Толстая гладкая клеточная стенка
Развитый единый хондриом
Специфические ферменты синтеза
Транспорт смеси фотоассимилятов

Сосуд ксилемы
Трансферная клетка-спутница
(Transfer Cell)
Ситовидный элемент флоэмы
Апопластическая загрузка флоэмы
Клетка
флоэмной
паренхимы
Плазмодесмы, контактирующие
с мезофиллом
Трансферная клетка-спутница:
Единичные плазмодесмы
Толстая складчатая клеточная стенка
Развитый единый хондриом
Сахарозно-протонный симпортер +
Н+-АТФаза на мембране (рН > 7)
5. Продукт транспорта – сахароза

Способы загрузки флоэмы как элемент адаптации
Симпластные растения
Апопластные растения

Способы загрузки флоэмы как элемент адаптации

Транспорт вирусных белков: viral movement protein (MP)
MP – неструктурные белки, кодируемые в вирусном геноме, основной функцией которых является распространение вирусной инфекции в теле растения хозяина; некоторые вирусы имеют несколько различных MP
MP вступают во взаимодействие с плазмодесмами клетки, в результате чего:
происходит увеличение SEL: 1kDa -> более 20kDa (не более 50kDa)
происходит распространение белка в соседнюю клетку
становится возможным межклеточный транспорт инфицирующих транскриптов вируса (РНК)
Одновременная инъекция flu.-labelled-MP и flu.-labelled-РНК – ведет к быстрому переносу протеонуклеинового комплекса в соседние клетки.
=>Плазмодесмы могут опосредовать избирательный межклеточный транспорт эндогенных белок-РНК комплексов.

Модели распространения вирусной инфекции
«шпикачки»
«селедка под шубой»
MP – virus MP 26kDa
vRNA – одноцепочечная РНК вируса
BP – binding protein
D – docking protein –белок-рецептор плазмодесм

Модель распространения инфекции клевера white clover mosaic virus - WClMV
LC – linker complex (кодируется растением)
26 – virus MP 26kDa
13 7 – TGBp – вирусный белок (функции до конца не выяснены)
RNA – одноцепочечная РНК вируса
CP – coat protein
DP – docking protein – предполагаемый белок-рецептор плазмодесм
Non-sequence-specific binding of single-stranded RNA+CP to the anchored 26MP

Эпидермальные клетки Arabidopsis thaliana, экспрессирующие MP17-GFP
Propidium iodide (окрашивание пектинов) маркирует клеточные стенки
Локализация - плазмодесмы

Другой белок - TMV MP30-GFP.
Видна локализация в плазмодесмах

Транспорт собственных белков: KN1 (KNOTTED1)
– фактор транскрипции, индуцирует дифференцировку клеток
Микроинъекция KN1 в клетки мезофилла растений кукурузы и табака вызывает эффекты, схожие с инъекцией MP:
Увеличение SEL 1.0kDa->40kDa
Быстрое распространение белка в соседние клетки
Также KN1 выступает посредником в межклеточном транспорте РНК, но, в отличии от вирусного MP, эндогенный фактор транскрипции успешно взаимодействует только с собственными последовательностями РНК (sequence specificity).

мРНК гена KN1 в апексе кукурузы
Листовой примордий 1
Листовой примордий 2
Новый листовой примордий
Темное окрашивание

Обобщенная модель транспорта больших молекул

Частичное разворачивание необходимо для транслокации белка через плазмодесму
Cross-linking experiments - препятствие разворачиванию белковой молекулы
Использовали наночастицы золота различных размеров: 1.4, 6, 15 nm (увеличивают общий размер молекулы) для выяснения механизма транслокации белков через плазмодесмы
Cross-linking KN1 – не вызывает увеличения SEL и не распространяется в соседние клетки
Конъюгаты: KN1-1.4nm gold – распространяется через плазмодесмы, но с меньшей эффективностью; KN1-6nm gold и KN1-15nm gold не распространяются и являются ингибиторами при транспорте KN1 wild type
Микроинъекции проведенные с MP CMV (cucumber mosaic virus) дают такие же результаты

Биотический стресс → ↑ салицилаты → ↑транскрипция PDL5 (plasmodesmata-located protein 5) → накопление PDL5 в области плазмодесм → интенсификация отложения каллозы → ограничение транспорта по симпласту (ограничение очага инфекции)
FLS2 (FLAGELLIN SENSING 2) и LYM2 – мембранные рецепторы бактериальной инфекции - локализованы в области плазмодесм и обеспечивают ограничение симпластного транспорта в случае инфекции
Готовы к худшему!

Каллоза (β 1-3 глюкан) откладывается в области шейки. Содержание каллозы непостоянно и находится в обратной корреляции с пропускной способностью плазмодесм.

Итак…
Плазмодесмы обеспечивают непрерывность симпласта
Через плазмодесмы идет диффузия ионов и малых молекул
Через плазмодесмы может идти транспорт белков и НК
Это могут быть как экзогенные(вирусные) белки/НК (MP, vRNA; такой транспорт лежит в основе распространения вирусов в организме растения)…
…так и эндогенные белки (факторы транскрипции KN1 и различные белки флоэмного экссудата PP, RPP13-1) и мРНК растения
Наличие и особенности функционирования плазмодесм лежат в основе взгляда на растение как на надклеточный организм
Регуляция транспорта по плазмодесмам может лежать в основе разделения симпласта на физиологические домены и «домены развития»

Белки, ассоциированные с плазмодесмами
С центральной полостью ассоциированы: TMV MP (обеспечивает транспорт vРНК) и At PDL5 (негативный регулятор транспорта).
При этом TMV MP и At PDL5 конкурируют за центральную область плазмодесм.
At PDLP1 (негативный регулятор транспорта), Zm CRINKLY4 (функции неизвестны) – ассоциированы с PDom.
At PDCB1 (PD-callose binding protein 1) увеличивает накопление каллозы и ограничивает пропускную способность плазмодесм
PdBG2 (β 1-3 glucanase) обеспечивает деградацию каллозы и увеличивает пропускную способность плазмодесм
Эти белки ассоциированы с шейкой плазмодесм.