МБ ЛК3, Тема3(2), Транскрипция

Тема 3(2). ФУНКЦИИ ДНК
ТРАНСКРИПЦИЯ

Т Р А Н С К Р И П Ц И Я
(прокариоты)

Транскрипция - это синтез всех видов РНК по матрице ДНК, осуществляемый ферментом ДНК-зависимой РНК-полимеразой.

Принципы транскрипции:
1. Комплементарность.
2. Антипараллельность.
3. Униполярность.
4. Беззатравочность.
5. Асимметричность.
РНК синтезируется комплементарно и антипараллельно транскрибируемой цепи ДНК. Рост цепи РНК идет только в направлении 5'→3'. Для начала синтеза РНК фермент не нуждается в поли- или олигонуклеотидной затравке.
Первый нуклеотид в РНК всегда пурин в форме трифосфата.

Понятие об опероне
Оперон - единица транскрипции у прокариот

Промотор - особая последовательность нуклеотидов ДНК, узнаваемая РНК-полимеразой как посадочная площадка и старт синтеза РНК.
Только с промотора может начаться синтез специфической РНК.
Терминатор - особая последовательность нуклеотидов ДНК, узнаваемая РНК-полимеразой как финиш транскрипции.
Цистрон - последовательность нуклеотидов ДНК, кодирующая один полипептид (в большинстве случаев - белок) или одну тРНК, или одну рРНК

Оператор - особая последовательность нуклеотидов ДНК, узнаваемая белком-репрессором.

Асимметричность
Транскрибируются обе цепи ДНК, но в каждом отдельном опероне только одна из них. Какая именно, определяется положением промотора и терминатора.

Особенности структуры промотора

Узнавание и прочное связывание происходит на разных участках ДНК.
Эти участки отличаются и по первичной, и по вторичной структуре. Путем секвенирования выявили структуру многих промоторов. У большинства из них имеется общее свойство.

Структура ДНК-зависимой РНК-полимеразы E.coli
6 субъединиц: 2α β β’ ω δ - холофермент
2α β β’ ω - core-фермент
Кофактор: ионы Mg

α2: две α-субъединицы связывают остальные элементы фермента и распознают регулирующие факторы. Каждая субъединица состоит из двух доменов: αCКД (С-концевой домен) связывает первый элемент промотора, и αNКД (N-концевой домен) связывается с остальными компонентами полимеразы.
β: эта субъединица обладает собственно полимеразным действием, катализируя синтез РНК. Она осуществляет инициацию процесса и управляет элонгацией.
β': неспецифически связывается с ДНК.
ω: восстанавливает денатурированную РНК-полимеразу обратно в дееспособную форму in vitro. Также обнаружено ее защитное/шаперонное действие на β'-субъединицу у Mycobacterium smegmatis.
Для связывания с промоторными областями ДНК, основной фермент нуждается в еще одной субъединице — сигма (σ). Сигма-фактор значительно снижает сродство РНК-полимеразы к неспецифичным областям ДНК, и в то же время повышает ее чувствительность к определенным промоторам, в зависимости от своей структуры. С его помощью транскрипция начинается с нужного участка ДНК.

Этапы транскрипции
1. Узнавание и прочное связывание

Примерно 5% промоторов у прокариот имеют только участок "-10", однако, тем не менее, хорошо узнаются РНК-полимеразой. Такие промоторы представлены палиндромными последовательностями, принимающими форму креста при суперспирализации кольцевых молекул ДНК.
Палиндромы - последовательности, которые читаются одинаково слева направо и справа налево.

2. Инициация заключается в образовании первой фосфодиэфирной связи между пурин-трифосфатом (АТФ или ГТФ) и следующим нуклеотидом. После инициации - фактор покидает фермент.
3. Элонгация - последовательное наращивание цепи РНК (или продолжение транскрипции).
4. Терминация. Специфическая терминация бывает:- - независимой и - зависимой.
"Мотором" транскрипции является энергия, высвобождающаяся при отщеплении пирофосфата от каждого рибо-НТФ.
Ингибиторы транскрипции
Рифампицин - ингибитор инициации.
Связывается с центром инициации holo-РНК-полимеразы E. сoli.
Стрептолидигин - ингибитор элонгации.
Связывается с центром элонгации core-РНК-полимеразы E. сoli.

СХЕМА ЭТАПОВ ТРАНСКРИПЦИИ

- независимая - зависимая
терминация терминация

- независимая терминация

Регуляция транскрипции у прокариот
Схема негативной индукции Жакоба и Моно
Lac-оперон E. coli содержит 3 гена, отвечающие за образование белков, участвующих в переносе в клетку дисахарида лактозы и в ее расщеплении.
Z - галактозидаза (расщепляет лактозу на глюкозу и галактозу).
Y - галактозидпермеаза (переносит лактозу через мембрану клетки).
А - тиогалактозидтрансацетилаза (ацетилирует галактозу).

Эта схема называется так потому, что контролирующим транскрипцию фактором является негативный фактор, "выключатель" - белок - репрессор. Индукция (включение) происходит при потере сродства белка - репрессора к оператору

Схема позитивной индукции Аra-оперон E. сoli
Эта схема регуляции называется позитивной индукцией, поскольку контролирующий элемент - белок - активатор "включает" работу оперона.

Схема позитивной репрессии
Оперон синтеза рибофлавина у Вacilus subtilis.
Позитивная репрессия, поскольку в регуляции участвует белок - активатор, а сама регуляция заключается в выключении транскрипции.

Схема негативной репрессии
Оперон синтеза триптофана у E. сoli.
Схема регуляции - негативная репрессия, потому что белок репрессор "выключает" оперон

Т Р А Н С К Р И П Ц И Я
(эукариоты)
ЛЕКЦИЯ 8

У эукариотов процессы транскрипции и трансляции разобщены во времени и пространстве (транскрипция - в ядре, трансляция - в цитоплазме).
У эукариотов существуют специализированные РНК-полимеразы.
В ядре выделяют 3 типа РНК-полимераз:
РНК-полимераза I - синтезирует рРНК (кроме 5S рРНК).
РНК-полимераза II - синтезирует мРНК и некоторые sРНК.
РНК-полимераза III - синтезирует тРНК, некоторые sРНК и 5SрРНК.
РНК-полимеразы различаются количеством субъединиц, их аминокислотным составом, и зависимостью от катионов магния и марганца. Для РНК-полимераз I и III необходимое для работы соотношение [Mn2+]/[Mg2+] = 2. Для РНК-полимеразы II - [Mn2+]/[Mg2+] = 5.
Помимо ядерных РНК-полимераз у эукариот есть еще РНК-полимеразы хлоропластов и митохондрий.

Особенности транскрипции эукариот
Единицей транскрипции у эукариот является отдельный ген, а не оперон, как у прокариот.
Оператор, как таковой, отсутствует. Промотор есть, но он организован иначе.
Базальные факторы транскрипции - белки, необходимые для инициации транскрипции
Базальные факторы транскрипции необходимы для инициации транскрипции всеми тремя ядерными РНК-полимеразами.

Для любого гена, кодирующего белок, есть энхансеры (усилители).
Энхансеры - последовательности ДНК, усиливающие транскрипцию при взаимодействии со специфическими белками.
М1+М2+М3+М4 - один энхансер, но он состоит из 4-х модулей.
Экспрессируются лишь те гены, у которых все энхансерные модули узнаны своими белками и эти белки взаимодействуют друг с другом

Экспрессируются лишь те гены, у которых все энхансерные модули узнаны своими белками и эти белки взаимодействуют друг с другом.
Кроме энхансеров есть сайленсеры (ослабители).
Сайленсеры - последовательности ДНК, ослабляющие транскрипцию при взаимодействии с белками.
При соответствующем наборе белков экспрессия отдельных генов в клетке может быть подавлена

Этапы транскрипции
Инициация – выбор фиксированного места начала транскрипции (специфическое связывание РНК-пол с матричной нитью), промотор
Элонгация – синтез РНК после оставления РНК-пол промотора (очищение промотора)
Терминация – окончание транскрипции, терминатор

Три этапа транскрипции
Инициация
Формирование транскрипционного пузырька
12-14 п.н.
Синтез РНК в направлении от 5’-конца к 3’-концу
Координаты транскрипции
Стартовая точка транскрипции, или
TSS – transcription start site (+1)
против хода
транскрипции
по ходу
транскрипции

Три этапа транскрипции
Элонгация
Нематричная нить – кодирующая (кодогенная)
Матричная нить –транскрибируемая
РНК-пол движется по нити ДНК в направлении 3’(ОН)→5’(РО4)
Записи в базах даны по кодирующей нити

РНК-полимераза II для осуществления своей работы требует много различных белковых факторов (транскрипционные факторы – ТФ).
РНК-полимераза II состоит из 12 субъединиц, часть которых выполняют функции, подобные субъединицам РНК-полимеразы прокариотов.
Самая большая субъединица на С-конце содержит много раз повторяющийся (консенсусный) гепта-повтор, очень важный для функции этого фермента.

Комплекс ДНК и РНК-полимеразы II

Белки, необходимые для инициации транскрипции на эукариотических промоторах РНК-полимеразой II

ИНГИБИТОРЫ РНК-ПОЛИМЕРАЗ
Актиномицин D и акридин – подавляют работу на стадии элонгации
α- аманитин (токсин бледной поганки) полностью подавляет работу РНК-полимеразы II в концентрации 10-8 М и РНК-полимеразы III ( в концентрации 10-6 М). РНК-полимераза I фактически нечувствительна к этому токсину.

Процессинг мРНК
Процессинг мРНК состоит из нескольких этапов.
1. Кепирование 100% мРНК
2. Полиаденилирование ~95% мРНК
3. Сплайсинг ~95% мРНК. Сплайсингу подвергаются только полиаденилированные мРНК.
4. Редактирование. Показано лишь для нескольких мРНК.
Все стадии процессинга мРНК происходят в РНП-частицах (рибонуклеопротеидных комплексах).
мРНК не бывает свободной от белков.
Полисома - комплекс мРНК с несколькими или многими рибосомами.
В составе информосом мРНК может жить от нескольких минут до нескольких дней, не подвергаясь действию нуклеаз

Процессинг мРНК

Кепирование
Кепирование - надевание "шапочки".
"Сар" представляет собой метилированный GTP, присоединенный в необычной позиции 5'-5' и две метилированные рибозы в первых двух нуклеотидах мРНК. По мере образования пре-мРНК (еще до 30-ого нуклеотида), к 5'-концу, несущему пуринтрифосфат, присоединяется гуанин, после чего происходит метилирование

Назначение “Кэп"
1. Защита 5'-конца мРНК от действия экзонуклеаз.
2. За счет узнавания “Кэп" связывающими белками происходит правильная установка мРНК на рибосоме

Полиаденилирование
Когда синтез пре-мРНК завершен, то на расстоянии примерно 20 нуклеотидов в направлении к 3' - концу от последовательности 5'-AAUAA-3' происходит разрезание специфической эндонуклеазой и к новому 3'-концу присоединяется от 30 до 300 остатков АMP (безматричный синтез).

мРНК ряда генов не полиаденилируется (например гистоновых генов).
Полиаденилированные пре-мРНК подвергаются сплайсингу.

Сплайсинг
Экзоны - кодирующие участки генов.
Интроны - некодирующие участки генов.
Сплайсинг - вырезание копий интронов из пре-мРНК и сшивание копий экзонов с образованием мРНК.

Для мРНК высших организмов существуют обязательные правила сплайсинга:
Правило 1. 5' и 3' концы интрона очень консервативны: 5'(GT-интрон-AG)3' .

Правило 2. При сшивании копий экзонов соблюдается порядок их расположения в гене, но могут быть выброшены некоторые из них.

Сплайсинг осуществляется белковыми комплексами - сплайсосомами, в которых помимо ферментов, вырезающих и сшивающих участки пре-мРНК, имеются белки, придающие про-мРНК нужную конформацию, и несколько sPНК. Сплайсосома непосредственно связана с ферментами, занимающимися полиаденилированием.

Редактирование
Редактирование - изменение генетической информации на уровне мРНК.
Пример- редактирование мРНК цитохромоксидазы у трипаносомы: когда трипаносома в человеке – синтезируется только две субъединицы цитохромоксидазы, в мухе – три.
Происходит сдвиг рамки считывания и отредактированная мРНК кодирует новый полипептид - третью субъединицу цитохромоксидазы

Процессинг РНК в клетках прокариот и эукариот
ЛЕКЦИЯ 9

Этапы реализации генетической информации
Транскрипция – синтез молекул РНК, образование первичного транскрипта (пре-РНК)
Процессинг –модификация первичного транскрипта (пре-РНК) и образование зрелых молекул РНК
Трансляция – синтез полипептида-предшественника белка
Процессинг белка – получение зрелого функционального белка

Процессинг РНК в клетках прокариот
Ген – это участок молекулы ДНК, кодирующий синтез функциональной молекулы РНК
Цистрон – участок молекулы мРНК, который кодирует синтез одной полипептидной цепи
Молекулы мРНК прокариот полицистронны, т.е. они служат матрицей для одновременного синтеза нескольких полипептидов
мРНК прокариот не процессируются

Процессинг рРНК и тРНК
Зрелые молекулы рРНК и тРНК образуются у прокариот и эукариот в результате эндо- и экзонуклеазных воздействий на их предшественники.
У эукариот в некоторых случаях вырезаются копии интронов из пре-рРНК и пре-тРНК

Гены рРНК и тРНК образуют транскрипционный блок (кластер).
Спейсер – это участок ДНК между генами.
РНКазы- ферменты, которые разрезают молекулы РНК.
Процессинг пре-рРНК у бактерий

Процессинг рРНК эукариот
Транскрипционный блок содержит гены 18S ; 5,8S; 28S - рРНК, разделенные спейсерами
три зрелые молекулы рРНК образуются при расщеплении спейсеров эдонуклеазой
Некоторые эукариоты содержат интрон в 28S пре- рРНК, который вырезается (аутосплайсинг) и образуется 26S рРНК

Процессинг пре-рРНК у эукариотов

Этапы процессинга тРНК прокариот:
Модификация 5’ – конца - РНКаза Р
Модификацию 3’ – конца осуществляет РНКаза D
Модификация некоторых азотистых оснований и формирование зрелой структуры тРНК

Этапы процессинга тРНК дрожжей (эукариоты)
Удаление интрона
Вырезание 5’ конца (лидер)
Удаление UU с 3’конца
Присоединение CCA к 3’концу -тРНК
Модификация азотистых оснований

Экзон-интронная структура генов эукариот
Структура α- и β-глобиновых генов
Экзоны (тёмно-красный цвет ), разделены интронами (голубой цвет). Цифры над генами указывают аминокислотные остатки кодируемого полипептида.
5’- 3’- не транслируемые области содержатся в первом и последнем экзонах (розовый цвет). Они присутствуют в зрелой мРНК, но не транслируются.

Этапы процессинга пре - мРНК эукариот
Кэпирование - модификация 5’-конца
Полиаденилирование - модификация 3’-конца
Сплайсинг - удаление интронов и соединение экзонов

Модификация 5’-конца – кэпирование
Кэп – это 7-метил-гуанозин соединенный в 5’-5’-ориентации с первым нуклеотидом мРНК
Кэп присоединяется с помощью фермента гуанозил-7-метилтрансферазы к первому 5’-трифосфату мРНК сразу после транскрипции с помощью особой 5’ - 5’- связи

Модификация 3’-конца пре-мРНК - полиаденилирование

Механизмы сплайсинга интронов:
Тип I - интроны подвергаются аутосплайсингу в присутствии только ионов Mg +2 и гуанозина (пре - рРНК Tetrahymena рhysarum)
Тип II – интроны подвергаются аутосплайсингу и имеют концевые последовательности 5’-GU_ AG-3’ (некоторые РНК митохондрий у дрожжей)
Тип III - интроны мРНК, имеющие концевые последовательности 5’GU_ AG3’, подвергаются сплайсингу в ядре с участием мяРНК

Сплайсинг интронов типа I

Сплайсинг ядерной мРНК происходит в сплайсосоме
Сплайсосома - специальная ядерная структура, в которой происходит сплайсинг
В состав сплайсосомы входят snРНК (U1, U2, U4, U5 и U6) и 145 молекул белков

Взаимодействие компонентов сплайсосомы с экзонами и интронами РНК

Механизмы альтернативного сплайсинга:
Альтернативный выбор промотора
Альтернативный выбор сигнала полиаденилирования
Альтернативный выбор разных наборов экзонов
Транс-сплайсинг

Экзон 4
Интрон 3
Экзон 3
Интрон 2
Экзон 2
Р2
Интрон 1
Экзон 1
Р1
Экзон 3
Экзон 1
Экзон 4
Экзон 4
Экзон 3
Экзон 2
1. Схема фрагмента гена, содержащего 2 промотора, 4 экзона и 3 интрона.
2. Фрагмент мРНК после сплайсинга (выбор промотора Р1)
3. Фрагмент мРНК после сплайсинга (выбор промотора Р2)
Направление транскрипции -

Альтернативный сплайсинг мРНК кальцитонинового гена у млекопитающих (крыса)

Структура мРНК прокариот
Лидер - это 5’ не транслируемый участок - 5’ UTR (UnTranslated Region)
Трейлер – это 3’ не транслируемый участок (3’UTR)
Рамка считывания –участок мРНК, кодирующий синтез полипептида – от старт кодона до стоп-кодона