Секреторная активность мезенхимных стромальных клеток жировой ткани человека в стимуляции роста кровеносных сосудов

Актуальность работы:
Достигнутый за последние несколько лет мировым научным сообществом прогресс отражается в активном внедрении в клиническую практику методов клеточной терапии. Разработке этой лечебной тактики способствовало развитие современных представлений о молекулярных и клеточных механизмах регуляции роста и ремоделирования кровеносных сосудов. Немаловажную роль в этих процессах играют мезенхимальные стромальные клетки.
Такие клетки обладают двумя важными свойствами – они способны дифференцироваться в широкий спектр различных типов клеток и продуцировать различные вещества, влияющие на ангиогенез.
Поэтому изучение секретируемых веществ поможет приблизиться к пониманию механизмов регуляции роста кровеносных сосудов и вклада МСК в эти процессы.

Цель работы:
оценить содержание ангиогенных факторов в среде культивирования и внеклеточных везикулах, продуцируемых МСК

Задачи:
Выделение и культивирование человеческих ЖТ-МСК;
Получение фракций внеклеточных везикул и белков в свободной форме ;
Анализ содержания белков и метаболитов;
Оценка влияния среды культивирования на рост кровеносных сосудов на моделях ангиогенеза in vitro.

Методы:
Выделение МСК из жировой ткани человека;
Культивирование МСК;
Иммунофенотипирование популяции МСК с помощью проточной цитофлуориметрии;
Нуклеофекция клеток культуры МСК;
Разделение кондиционированной среды культивирования на фракции, содержащие внеклеточные везикулы или белки
Исследование содержания белков и метаболитов методом ИФА
Оценка влияния фракций среды культивирования на рост кровеносных сосудов in vitro: модели scratch-assay, двухмерного ангиогенеза в Матригеле, трёхмерного ангиогенеза в фибриновом геле.

Культура:
human ADSC (adipose tissue-derived stem cells)
МСК-ЖТ человека (мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани)
Среда культивирования:
AdvanceSTEM Mesenchymal Stem Cell Media,
10% AdvanceSTEM Supplement (HyClone),
1% antibiotic–antimycotic solution (HyClone)
в инкубаторе
при 37°C и 5% CO2

Мезенхимные стромальные клетки из липоаспирата
(стрелками указаны хорошо распластанные клетки)
а - 24 часа культивирования,
Б - 120 часов культивирования
Фазово-контрастная микроскопия, масштабные линейки-100 мкм
(Л.Б.Буравкова и др., Характеристика мезенхимных стромальных клеток из липоаспирата человека, культивируемых при пониженном содержании кислорода, 2009)
Внешний вид культуры

Нуклеофекция
Образцы:
1 - отрицательный контроль (Ambion, Pre-miR, Negative control #1)
2 - miR-92a (Ambion, Pre-miR, РМ 10916, Cat. # AM17100, 5 nmol)
3 - anti-miR-92a (Ambion, anti-miR АМ 10916, Cat. # AM17100, 5 nmol)
4 - pmaxGFP (в наборе, 0,5 мкг/мл) – контроль эффективности нуклеофекции
Программа а-23.

Жизнеспособность
5
Жизнеспособность МСК после нуклеофекции
Жизнеспособность HUVEC после после 24 ч инкубации с кондиционированной средой

Модель двухмерного ангиогенеза в Матригеле (tube assay)
Длина капилляроподобных структур была посчитана в 5 случайных полях зрения в каждой лунке (увеличение 10x) с использованием программы MetaMorph 5.0

Модель двухмерного ангиогенеза в Матригеле (tube asssay)
Позитивный контроль
Негативный контроль
Pre-miRNA
Anti-miRNA
100µm
100µm
100µm
100µm

ELISA
5
Содержание Angpt-1 в кондиционированной среде от МСК, нормированное на число клеток,
отн. единицы
Содержание HGF в кондиционированной среде от МСК, нормированное на число клеток,
отн. единицы

Модель трёхмерного ангиогенеза в фибриновом геле (fibrin bead assay)
Схема эксперимента
2 день культивирования, начало образования капилляроподобных структур
5 день культивирования, образуется большое количество тонких сосудов
7 день культивирования, формирования сложной сети и
анастомозов между соседними сосудами
50 µm
50 µm
50 µm
N. Nakatsu, 2003