Секреторная мембранная система. Аппарат Гольджи. Лекция 9

Секреторная мембранная система
В клетках эукариот белки, предназначенные для выведения из клетки, для внутриклеточного использования (гидролитические ферменты) и мембранные белки, проходят через секреторную систему.
Секреторная система - серия функционально различающихся мембранных компартментов, куда входят сайты экспорта ЭПР (ERES), аппарат Гольджи, различные везикулярные органеллы.
Функции секреторной системы:
1) доставка белков и липидов, синтезированных в ЭПР, к плазматической мембране и клеточным компартментам;
2) модификация, сортировка и хранение белков и липидов;
3) создание и поддерживание уникальной идентичности и функций ЭПР, аппарата Гольджи и плазматической мембраны.

Общая схема строения секреторной мембранной системы и направления транспортных потоков в клетке (антероградный и ретроградный транспорт)
Cell Biology, 2016
Антероградный транспорт - поток везикул-переносчиков по секреторной системе от ЭПР через аппарат Гольджи к плазматической мембране.
Ретроградный транспорт - транспорт везикул в сторону ЭПР.
Между всеми компонентами секреторной системы идет постоянный поток мембранных везикул в ту и в другую сторону. Это и есть везикулярный транспорт.

Везикулярный транспорт между разными мембранными компартментами
В ходе везикулярного транспорта происходит постоянный обмен компонентами между закрытыми мембранными компартментами, которые объединяются и составляют биосинтетический, секреторный и эндоцитозный путь. Везикулы (А) и более крупные транспортные переносчики (В) отпочковываются от донорских компартментов и сливаются с таргетными/акцепторными компартментами.
Cell Biology, 2016
Molecular Cell Biology, 2014

Нобелевскую премию по медицине в 2013 году присудили за исследования, посвященные механизмам везикулярного транспорта.
Джеймс Ротман, Ренди Шекман и Томас Зюдов

Использование разных белковых покрытий для везикулярного транспорта
Разные покрывающие белки «выбирают» разные транспортные везикулы/переносчики в биосинтетическом, секреторном и эндоцитозном потоке. Красные стрелки – антероградный транспорт, синие стрелки – ретроградный транспорт, зеленые стрелки – эндоцитоз.
Molecular Cell Biology, 2014

Как выглядят разные белковые покрытия на транспортных везикулах
Molecular Cell Biology, 2014
Cell Biology, 2016
Клатриновое покрытие и COPI покрытие снимается почти сразу после того, как везикула отделилась от донорского компартмента.
Везикулы с COPII покрытием утрачивают его непосредственно перед слиянием с таргетной мембраной.

Клатриновое покрытие на транспортных везикулах
Molecular Cell Biology, 2014
Основной компонент клатринового покрытия - белок клатрин. Каждая субъединица клатрина состоит из трех больших и трех малых полипептидных цепей, которые образуют структуру из трех ножек – трискелион. Такие трискелионы собираются в корзинки и формируют гексагональные и пентагональные каркасы на цитозольной поверхности мембраны.
трискелион

Сборка и разборка клатринового покрытия
Рецепторы «собирают» молекулы карго (белков) для упаковки в везикулу. Сборка покрытия начинается с прикрепления к рецепторам адаптерных белков (AP - adaptor proteins), которые затем рекрутируют клатрин. После отпочковывания везикулы, клатриновое покрытие снимается.
Molecular Cell Biology, 2014

Сборка клатринового, COPI и COPII покрытий нужна для сортировки рецепторов, связанных с карго, и контролируется белками семейства малых ГТФаз - coat recrtuitment GTPases:
Sar1-ГТФаза отвечает за сборку COPII покрытия, который участвует в формировании везикул от сайтов экспорта ЭПР (ERES).
Arf1-ГТФаза отвечает за сборку COPI покрытия, который участвует в ретроградном транспорте везикул от аппарата Гольджи, и сборку клатринового покрытия.

Формирование COPII покрытия на везикулах, отщепляющихся от ERES (ER Exit Sites)
Molecular Cell Biology, 2014
1
2
3
COPII покрытие состоит из белков Sec23/24 (внутренняя часть каркаса) и Sec13/31 (внешняя часть каркаса)

При образовании везикул-переносчиков, на донорских мембранах собирается белковое покрытие из клатрина, COPI или COPII, которое сортирует рецепторы и создает изменение упругости мембраны. Это также первый этап сортировки и маркировки «груза» в люмен везикул.
Для того чтобы обеспечить направленный перенос, везикулы должны селективно узнавать только те мембраны, с которыми они должны сливаться. Этот процесс зависит от:
1) Rab белков (Rab GTPases), которые направляют везикулы к мембране, с которой должно произойти слияние;
2) эффекторных белков, которые участвуют в узнавании определенных Rab белков и способствуют взаимодействию транспортных везикул с таргетными компартментами;
3) белков SNARE, которые обеспечивают слияние билипидных слоев.

Rab белки относятся к семейству малых ГТФаз
Rab-ГТФазы обеспечивают взаимодействие между транспортными везикулами и «docking complexes» (места причаливания) на таргетных/акцепторных мембранах. У млекопитающих есть примерно 70 разных Rab белков, которые обеспечивают специфичность транспортных процессов в секреторной системе разных типов клеток. У каждого Rab белка есть свои GEF и GAP регуляторы.
Molecular Cell Biology, 2014

Локализация белков семейства Rab на клеточных мембранах (Bhuin and Roy, 2014)

Эффекторные белки для Rab (Bhuin and Roy, 2014)

Эффекторные белки на примере ”tethering proteins”
Эффекторные белки (гольджины GMAP-120) отходят от таргетной мембраны и захватывают везикулы с помощью ALP домена. Белки Rab на везикуле взаимодействуют с Rab binding sites на эффекторном белке. Это переносит везикулу ближе к поверхности таргетной мембраны и способствует взаимодействию с белками SNARE, которые и осуществляют слияние.
Cell Biology, 2016

Непосредственное слияние мембран катализируется белками семейства SNARE
В функциональном плане SNARE белки существуют в виде комплементарных наборов – vSNARE - (от Vesicles - находятся в везикулах, обычно 1 копия) и tSNARE – (от Target - находятся в мембранах органелл, куда идет доставка, обычно 2-3 копии).
Все они имеют характерные спиральные домены; когда vSNARE взаимодействует с tSNARE, спиральные домены взаимодействуют и формируют стабильный четырехспиральный комплекс (stable SNARE complex).

Белки семейства SNARE - SNAP (Soluble NSF Attachment Protein) REceptor") [NSF -N-ethylmaleimide-sensitive factor/N-ethylmaleimide sensitive fusion proteins]
Выделяют два класса белков SNARE - R-SNARE (работают как v-SNARE) и Q-SNARE (работают как t-SNARE).
Для R-SNARE характерно то, что в формировании корового SNARE комплекса, участвует аргинин (R).
У Q-SNARE в формирование корового комплекса вносит вклад глутамин (Q).
Белки Q-SNARE делятся на субклассы Qa, Qb, Qc.
Функциональный SNARE комплекс сформирован четырьмя спиральными пучками, и для его формирования нужны “one of each of the Qa-, Qb-, Qc- and R-SNAREs”.

R-SNARE работают как v-SNARE и Q-SNARE работают как t-SNARE

Как Rab белки, эффекторные белки и комплекс SNARE участвуют в узнавании, прикреплении и слиянии транспортных везикул с мембраной
Molecular Cell Biology, 2014
SNARE комплекс при слиянии синаптического пузырька с мембраной нейрона

Mechanisms of vesicle budding and fusion
(Bonifacino and Glick, 2004)
После завершения слияния везикул, коровый комплекс SNARE разбирается при участии АТФазы NSF и ее ко-фактора α-SNAP (α-soluble NSF-attachment protein).

Антероградный и ретроградный транспорт между ЭПР и аппаратом Гольджи
Molecular Cell Biology, 2014
Возвращение резидентных белков люмена ЭПР (имеющих последовательность KDEL) из аппарата Гольджи. Этот процесс идет при помощи рецепторных белков, узнающих и сортирующих белки с KDEL последовательностями, в везикулы с COPI покрытием.

Везикуло-тубулярный кластер (Vesicular-Tubular Cluster or VTC), формирующийся между сайтом выхода из ЭПР (ER Exit Sites or ERES) и аппаратом Гольджи называется ERGIC (ER Golgi Intermediate Compartment)
Molecular Cell Biology, 2014

Аппарат Гольджи состоит из структурно-функциональных единиц – стопок аппарата Гольджи
Molecular Cell Biology, 2014
Стопки (stacks) имеют выраженную цис- и транс- полярность, которая отражает прохождение синтезированных в ЭПР белков. Белки из ЭПР входят в стопки с лицевой (цис) стороны. После прохождения через цистерны в средней части, карго затем покидает аппарат Гольджи с транс-стороны.

Compartments of the secretory pathway: immunofluorescence images of HeLa cells stained with markers of the secretory pathway
Tomasz Szul, and Elizabeth Sztul Physiology 2011;26:348-364
©2011 by American Physiological Society

Функции комплекса Гольджи
1) В комплексе Гольджи продолжается дальнейшая модификация/процессинг гликопротеидов (вторичное гликозилирование); соединение синтезированных олигосахаридов с белками, поступившими из ЭПР (образование протеогликанов).
2) Комплекс Гольджи функционирует как станция по сортировке белков для их последующей доставки по определенному адресу. Это включает транспорт к плазматической мембране, секрецию, сортинг в эндосомы/лизосомы, и обратно в ЭПР.
3) Фосфорилирование олигосахаридов в цис-части комплекса Гольджи регулирует адресование белков в эндсомно-лизосомный компартмент.
4) Биосинтез и метаболизм липидов. В комплексе Гольджи синтезируются сфингомиелин и гликосфинголипиды.

Функциональная компартментализация комплекса Гольджи подразумевает то, что функции, связанные с модификацией, сортировкой и адресованием карго, выполняются в определенных отсеках комплекса Гольджи
Molecular Cell Biology, 2014

ФУНКЦИИ АППАРАТА ГОЛЬДЖИ:
1. ПРОЦЕССИНГ ГЛИКОПРОТЕИДОВ (ВТОРИЧНОЕ ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЕ) И СИНТЕЗ ПРОТЕОГЛИКАНОВ

В комплексе Гольджи продолжается дальнейшая модификация/процессинг гликопротеидов (вторичное гликозилирование)
Олигосахаридный предшественник добавленный к белку в ходе N-гликозилирования в ЭПР (пять сахаров отмеченные серым цветом образуют «коровый участок» олигосахарида).
Molecular Cell Biology, 2014

Первичный тримминг олигосахаридных остатков в ЭПР
Molecular Cell Biology, 2003 (ed. Lodish H.)
Присоединение сахарных остатков осуществляют ферменты гликозил-трансферазы, а отщепление – гликозидазы/гликозил гидролазы (глюкозидазы, маннозидазы).

Два основных класса N-связанных олигосахаридов, обнаруженных среди зрелых гликопротеидов млекопитающих
Molecular Cell Biology, 2014

Образование высокоманнозных и сложных N-связанных олигосахаридов начинается в среднем участке, и завершается в транс-сети комплекса Гольджи
Molecular Cell Biology, 2014
Три типа гликозилтрансфераз добавляют работают последовательно, используя в качестве субстрата сахарные остатки (GlcNAC, Gal, NANA), которые активированы путем присоединения к соответствующим нуклеотидам.
Цели гликозилирования: правильное укладывание белков препятствуетих агрегации; защитные свойства белков; узнавание белков; регуляторные функции белков.

N- и O- гликозилирование
Molecular Cell Biology, 2014
O-связанные олигосахариды образуются путем присоединения углеводных цепочек к гидроксильной группе (О) на аминокислотах серине и треонине. Этот процесс называется О-связанным гликозилированием и начинается в ЭПР с добавления коротких олигосахаридов к серину и треонину (если этих аминокислот много, то и олигосахаридных хвостиков будет много). Затем в комплексе Гольджи гликозил-трансферазы добавляют множество копий одного и того же дисахарида к полисахаридной цепи. Коровый белок, на который присоединяются такие сахарные остатки, является основой протеогликанов. Протеогликаны – важный компонент внеклеточного матрикса

Разные типы молекул протеогликанов
Коровые белки показаны розовым или лиловым цветом, а глюкозамингликаны показаны разными цветами. Белки названы в соответствии с их характеристиками: аггрекан агрегирует вдоль гиалуронана; декорин декорирует коллагеновые фибриллы; перлекан похож на нитку жемчуга; серглицин имеет 24 ser-gly повтора; синдекан прикрепляет клетки к матриксу; глипикан имеет GPI якорь. CS - chondroitin sulfate; DS - dermatan sulfate; Hep - heparin; HS - heparan sulfate; KS - keratan sulfate.

Биосинтез и метаболизм липидов в комплексе Гольджи
Одной из функций комплекса Гольджи является синтез сфинголипидов.
Основой молекулы сфинголипидов является церамид.
Цермид синтезируется в ЭПР и доставляется в комплекс Гольджи, где затем модифицируется до глюкозилцерамида и сфингомиелина.
Сфинголипиды (сфингомиелин) и гликосфинголипиды (глюкозилцерамид и галактозилцерамид), играют важную роль в сортировке мембран в комплексе Гольджи и в пост-Гольджи компартментах.