Влияние поллютантов на возникновение мутаций у бактерий

Основные источники поступления антибиотиков в биосферу и глобальная сеть путей горизонтального переноса генов устойчивости к ним.
Красными стрелками показано поступление антибиотиков, оранжевыми — перемещение антибиотиков и генов устойчивости к ним, голубыми — передача только генов устойчивости
Панрезистентные штаммы – это штаммы микроорганизмов, которые устойчивы ко всем известным классам антибиотиков.

Цель:
Изучить влияние поллютантов на возникновение рифампицин-устойчивых мутантов бактерий рода Pseudomonas .
Задачи:
1. Проследить влияние солей тяжелых металлов(HgСl2,CuSO4) на возникновение рифампицин-устойчивых мутантов бактерий рода Pseudomonas .
2. Проследить влияние пестицидов (клопиралид и глифосат) на возникновение рифампицин-устойчивых мутантов бактерий рода Pseudomonas.
3. Проследить влияние антисептических препаратов (хлоргексидина, диоксидина) на возникновение рифампицин-устойчивых мутантов бактерий рода Pseudomonas.
4. Проследить влияние антибиотиков (ампициллина, тетрациклина) на возникновение рифампицин-устойчивых мутантов бактерий рода Pseudomonas.
5. Сравнить действие поллютантов различных групп на выбранный штамм.
6. Проанализировать полученные результаты.
7. Сделать выводы по данным эксперимента.

Объектом нашего исследования является штамм Pseudomonas putida, выделенный из донных отложений импактной зоны Новочеркасской ГРЭС.
Предметом исследования является частота встречаемости рифампицин-устойчивых мутантов Pseudomonas putida.
21-часовая культура Pseudomonas putida
Pseudomonas putida

Получение рифампицин-резистентных мутантов P. Putida
Культура была получена путем роста клеток до поздней логарифмической фазы роста в среде M9, содержащей глюкозу и гидролизат казеина, в конечных концентрациях 0,2% и 0,4% соответственно.
Полученную культуру разводили свежей средой М9 до 1*108 кл/мл и подращивали в течение 18 часов

Анализ рифампицин-резистентных мутантов
Ночную культуру разводили средой М9 до плотности 2*109 кл/мл, 100 мкл полученной суспензии вносили на чашки с LB с добавлением М9 и рифампицина. Количество выросших колоний учитывали через 72 ч. после начала инкубации.

Бактериальные штаммы, среды, мутагены:
Для получения рифампицин-резистентных мутантов использовали штамм Pseudomonas putida .
Для оценки влияния различных токсических веществ на возникновение рифампицин-резистентных мутантов:
Антибиотики: ампициллин и окситетрациклина гидрохлорид (0,025 мг/мл, 0,0025 мг/мл, 0,00025 мг/мл);
Антисептические средства: хлоргексидин (0,05 мг/мл, 0,005 мг/мл, 0,0005 мг/мл) и диоксидин (1 мг/мл, 0,1 мг/мл, 0,01 мг/мл);
Пестициды: клопиралид (0,03 мг/мл, 0,003 мг/мл, 0,0003 мг/мл) и глифосат (концентрацией 6,7 мг/мл; 0,67 мг/мл; 0,067 мг/мл)
Соли тяжелых металлов: хлорид ртути(HgCl2)(концентрацией 0,0272 мг/мл; 0,00272 мг/мл, 0,000272 мг/мл) и сульфат меди(CuSO4) (концентрацией 0,1 мг/мл; 0,01 мг/мл; 0,001 мг/мл).

1. Хлоргексиди́н — лекарственный препарат, антисептик, в готовых лекарственных формах используется в виде биглюконата (Chlorhexidini bigluconas). Хлоргексидин успешно применяется в качестве кожного антисептика и дезинфицирующего средства уже более 60 лет.
Обладает бактерицидным и фунгицидным эффектом.
Хлоргексидин

2. Гидроксиметилхиноксилиндиоксид (диоксидин) — лекарственное средство, обладающие широким спектром антибактериальной активности (особенно в отношении анаэробов). Действует бактерицидно.
Диоксидин эффективен в лечении тяжёлых гнойно-инфекционных процессов. Вместе с тем препарат токсичен, что ограничивает его применение в педиатрии в качестве системного медикамента.
Возможно развитие лекарственной устойчивости бактерий. При введении характеризуется малой терапевтической широтой, в связи с чем необходимо строгое соблюдение рекомендуемых доз.
диоксидин

Рисунок 1 – Частота встречаемости мутантов Pseudomonas putida под воздействием хлоргексидина

Рисунок 2 – Частота встречаемости мутантов Pseudomonas putida под воздействием диоксидина

Ампициллин:
Ампициллин – полусинтетический антибиотик. Разрушается пенициллиназой. В медицинской практике применяют ампициллин, ампициллина натриевую соль, ампициллина тригидрат.

Тетрациклин:
Тетрациклин – антибиотик из семейства тетрациклинов. Основой молекулы тетрациклиновых антибиотиков является полифункциональное гидронафтаценовое соединение.
Нарушает образование комплекса между транспортной РНК и рибосомой, что приводит к нарушению синтеза белка. Активен в отношении как грамотрицательных так и грамположительных бактерий.

Рисунок 3 – Частота встречаемости мутантов Pseudomonas putida под воздействием тетрациклина

Рисунок 4 – Частота встречаемости мутантов Pseudomonas putida под воздействием ампициллина

Сульфат меди (II):
Неорганическое соединение, медная соль серной кислоты с формулой CuSO4. Нелетучее, не имеет запаха. Сульфат меди(II) — важнейшая из солей меди. Часто служит исходным сырьём для получения других соединений.
CuSO4

Хлорид ртути (HgCl2):
Хлорид ртути — бесцветное кристаллическое растворимое в воде и очень ядовитое соединение. Применяется для целей наружной дезинфекции как антисептическое средство в растворах для дезинфекции кожи, белья, одежды, предметов ухода за больными, для обмывания стен. Катализатор органического синтеза.

Рисунок 5 – Частота встречаемости мутантов Pseudomonas putida под воздействием сульфата меди(II)

Рисунок 6 – Частота встречаемости мутантов Pseudomonas putida под воздействием хлорида ртути (II)

Клопиралид:
Пестицид, послевсходовый гербицид с высокой гербицидной активностью по отношению к сорнякам, устойчивым к арилоксиалканкарбоновым кислотам и их производным. Имеет вид белых кристаллов. При обычных условиях хранения устойчив. С основаниями образует водорастворимые соли. Длительное действие препарата обеспечивается за счет проникновения действующего вещества в корневую систему.

Глифосат:
Пестицид, арборицид, гербицид с широким спектром активности. Обладает избирательным и сплошным действием, применяется для подавления однолетних и многолетних сорняков. В воде устойчив. Уменьшение уровня глифосата в водной системе происходит за счет влияния микрофлоры и в результате воздействия ульрафиолетового излучения

Рисунок 7 – Частота встречаемости мутантов Pseudomonas putida под воздействием глифосата

Рисунок 8 – Частота встречаемости мутантов Pseudomonas putida под воздействием клопиралида

Было выявлено, что наибольшей мутагенной активностью из представленных веществ обладают пестициды.
Тетрациклин, диоксидин и хлорид ртути во всех исследованных концентрациях (включая самые низкие), оказали ярко выраженное подавляющее действие на возникновение мутантов.
Хлоргексидин показал высокую эффективность только при использовании рекомендованной концентрации, при концентрации в 10 и в 100 раз меньше, почти не подавлял развитие мутантов.
Также было выявлено, что ампицилин обладает мутагенной активностью, которая увеличивается с концентрацией. CuSO4 обладает небольшой мутагенной активностью.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ в рамках научного проекта № 6.2379.2017/ПЧ

Franz J. E. et al. Glyphosate: a unique global herbicide. – American Chemical Society, 1997.
2. Ivanović S., Lilić S. Presence of Campylobacter coli in slaughtered pigs and its resistance to antibiotics //Biotechnology in Animal Husbandry. – 2007. – Т. 23. – №. 5-6-1. – С. 403-410.
3. Ампициллин // Википедия. [2017—2017]. Дата обновления: 14.05.2017. URL: http://ru.wikipedia.org/?oldid=85404583 (дата обращения: 14.05.2017).
4. Stewart P. S. Mechanisms of antibiotic resistance in bacterial biofilms //International Journal of Medical Microbiology. – 2002. – Т. 292. – №. 2. – С. 107-113.
5. Benveniste R., Davies J. Mechanisms of antibiotic resistance in bacteria //Annual review of biochemistry. – 1973. – Т. 42. – №. 1. – С. 471-506.
6. Хлоргексидин // Википедия. [2018—2018]. Дата обновления: 19.02.2018. URL: http://ru.wikipedia.org/?oldid=91035315 (дата обращения: 19.02.2018).
7. Супотницкий М. В. Механизмы развития резистентности к антибиотикам у бактерий //Биопрепараты. – 2011. – №. 2. – С. 4.
8. Глифосат // Википедия. [2018—2018]. Дата обновления: 26.01.2018. URL: http://ru.wikipedia.org/?oldid=90530324 (дата обращения: 26.01.2018).
9. Jatsenko T. et al. Molecular characterization of Rif r mutations in Pseudomonas aeruginosa and Pseudomonas putida //Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. – 2010. – Т. 683. – №. 1. – С. 106-114.
10. Ma X. et al. rpoB gene mutations and molecular characterization of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from Shandong Province, China //Journal of clinical microbiology. – 2006. – Т. 44. – №. 9. – С. 3409-3412
11. Chopra I., Roberts M. Tetracycline antibiotics: mode of action, applications, molecular biology, and epidemiology of bacterial resistance //Microbiology and