Лекция 5. Флуорофоры для оптического имиджинга

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Иммуногистохимические методы – методы микроскопического исследования тканей, обеспечивающий наиболее специфическое выявление в них искомых веществ и основанный на обработке срезов маркированными специфическими антителами к выявляемому веществу, которое в данной ситуации служит антигеном

Антитела, конъюгированные с флюоресцентной меткой
Антитела — крупные глобулярные белки плазмы крови, выделяющиеся плазматическими клетками иммунной системы и предназначенные для нейтрализации клеток патогенов (бактерий, грибов, многоклеточных паразитов) и вирусов, а также белковых ядов и некоторых других чужеродных веществ
АНТИТЕЛА
ПЕРВИЧНЫЕ
ВТОРИЧНЫЕ
Первичные антитела связываются напрямую с антигеном
Вторичные антитела помогают обнаруживать, сортировать или очищать интересующие антигены путем связывания с первичным антителом

Схема непрямого иммуногистохимического метода. Первичные антитела связываются с антигеном исследуемого организма, а вторичные антитела, несущие флуоресцентную метку (флуорофор), связываются с первичными антителами
https://www.zin.ru/projects/neuromorphology/methods/immuno.html#

ДОСТОИНСТВА ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ
высокая специфичность к конкретным химическим веществам и определение их точной локализации
возможность с помощью конфокальной лазерной и мультифотонной микроскопии при использовании флуоресцентных красителей создавать высокоточные трехмерные реконструкции архитектоники нервных сетей определенной эргичности, включая у мелких животных возможность изучения нервной системы в целом на их тотальных препаратах
возможность сочетать выявление нервных элементов с гистохимическим окрашиванием мускулатуры животного с помощью фаллоидина, что дает возможность для изучения их пространственных взаимоотношений
НЕДОСТАТКИ ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ
отсутствие возможности выявлять общую цитоархитектонику нервной системы (включая локализацию клеточных тел) и ее отдельных отделов
невозможность выявить детально форму клеток и их отростков, а также связи между нейронами разной эргидности (за исключением 2–3 веществ одновременно), поскольку выявляются только места локализации в нейронах определенных химических веществ, поверхностные мембраны не маркируются и форма клеток не выявляется

https://www.researchgate.net/publication/229152947_Comparative_study_of_the_three_different_fluorophore_antibody_conjugation_strategies

Fluorescence-guided Surgery with a Fluorophore-conjugated Antibody to Carcinoembryonic Antigen (CEA), that Highlights the Tumor, Improves Surgical Resection and Increases Survival in Orthotopic Mouse Models of Human Pancreatic Cancer
Cristina A. Metildi MD, Sharmeela Kaushal PhD, Minya Pu MA, Karen A. Messer PhD, George A. Luiken MD, Abdool R. Moossa MD, Robert M. Hoffman PhD & Michael Bouvet MD, FACS
Annals of Surgical Oncology volume 21, pages1405–1411(2014) 685 Accesses
Abstract
Background
We have developed a method of distinguishing normal tissue from pancreatic cancer in vivo using fluorophore-conjugated antibody to carcinoembryonic antigen (CEA). The objective of this study was to evaluate whether fluorescence-guided surgery (FGS) with a fluorophore-conjugated antibody to CEA, to highlight the tumor, can improve surgical resection and increase disease-free survival (DFS) and overall survival (OS) in orthotopic mouse models of human pancreatic cancer.
Methods
We established nude-mouse models of human pancreatic cancer with surgical orthotopic implantation of the human BxPC-3 pancreatic cancer. Orthotopic tumors were allowed to develop for 2 weeks. Mice then underwent bright-light surgery (BLS) or FGS 24 h after intravenous injection of anti-CEA-Alexa Fluor 488. Completeness of resection was assessed from postoperative imaging. Mice were followed postoperatively until premorbid to determine DFS and OS.
Results
Complete resection was achieved in 92 % of mice in the FGS group compared to 45.5 % in the BLS group (p = 0.001). FGS resulted in a smaller postoperative tumor burden (p = 0.01). Cure rates with FGS compared to BLS improved from 4.5 to 40 %, respectively (p = 0.01), and 1-year postoperative survival rates increased from 0 % with BLS to 28 % with FGS (p = 0.01). Median DFS increased from 5 weeks with BLS to 11 weeks with FGS (p = 0.0003). Median OS increased from 13.5 weeks with BLS to 22 weeks with FGS (p = 0.001).
Conclusions
FGS resulted in greater cure rates and longer DFS and OS using a fluorophore-conjugated anti-CEA antibody. FGS has potential to improve the surgical treatment of pancreatic cancer.

Флюоресцентные белки
http://www.bio.msu.ru/res/DOC405/MFK_2013-2014_bioraznoobrazie_8_Lukyanov.pdf

https://www.youtube.com/watch?v=FiokGqqWFak

https://i.pinimg.com/originals/96/d7/bd/96d7bdfa5458c5122fc2afd593399a7c.jpg
Зеленый флуоресцентный белок, GFP
Генетически кодируется
Сам образует хромофор
Не нуждается в низкомолекулярных кофакторах и субстратах

https://www.youtube.com/watch?v=FiokGqqWFak

https://www.youtube.com/watch?v=FiokGqqWFak

https://www.youtube.com/watch?v=FiokGqqWFak

http://www.bio.msu.ru/res/DOC405/MFK_2013-2014_bioraznoobrazie_8_Lukyanov.pdf

http://www.bio.msu.ru/res/DOC405/MFK_2013-2014_bioraznoobrazie_8_Lukyanov.pdf

http://www.bio.msu.ru/res/DOC405/MFK_2013-2014_bioraznoobrazie_8_Lukyanov.pdf

http://www.bio.msu.ru/res/DOC405/MFK_2013-2014_bioraznoobrazie_8_Lukyanov.pdf

http://www.bio.msu.ru/res/DOC405/MFK_2013-2014_bioraznoobrazie_8_Lukyanov.pdf
промотор

http://www.bio.msu.ru/res/DOC405/MFK_2013-2014_bioraznoobrazie_8_Lukyanov.pdf

http://www.bio.msu.ru/res/DOC405/MFK_2013-2014_bioraznoobrazie_8_Lukyanov.pdf

http://www.bio.msu.ru/res/DOC405/MFK_2013-2014_bioraznoobrazie_8_Lukyanov.pdf

http://www.bio.msu.ru/res/DOC405/MFK_2013-2014_bioraznoobrazie_8_Lukyanov.pdf

http://www.bio.msu.ru/res/DOC405/MFK_2013-2014_bioraznoobrazie_8_Lukyanov.pdf

http://www.bio.msu.ru/res/DOC405/MFK_2013-2014_bioraznoobrazie_8_Lukyanov.pdf

http://www.bio.msu.ru/res/DOC405/MFK_2013-2014_bioraznoobrazie_8_Lukyanov.pdf

http://www.bio.msu.ru/res/DOC405/MFK_2013-2014_bioraznoobrazie_8_Lukyanov.pdf

http://www.bio.msu.ru/res/DOC405/MFK_2013-2014_bioraznoobrazie_8_Lukyanov.pdf

http://www.bio.msu.ru/res/DOC405/MFK_2013-2014_bioraznoobrazie_8_Lukyanov.pdf

http://www.bio.msu.ru/res/DOC405/MFK_2013-2014_bioraznoobrazie_8_Lukyanov.pdf

http://www.bio.msu.ru/res/DOC405/MFK_2013-2014_bioraznoobrazie_8_Lukyanov.pdf

http://www.bio.msu.ru/res/DOC405/MFK_2013-2014_bioraznoobrazie_8_Lukyanov.pdf

КАЛЬЦИЙ- И ДРУГИЕ ПОТЕНЦИАЛ- ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ КРАСИТЕЛИ
https://els-jbs-prod-cdn.jbs.elsevierhealth.com/cms/attachment/542308/3790944/gr1.jpg

Кальций-чувствительные красители
https://www.youtube.com/watch?v=y6Ro_gxl_HE

СЕРДЕЧНЫЕ ГЛИКОЗИДЫ
Механизм действия
Нарушают работу Na+/K+-АТФазы, что ведет к снижению выведения из клетки 3Na+ и поступления 2K+.
Из-за избыточного содержания ионов Na+ в клетке нарушается работа Na+/Са2+-антипорта, что ведет к накоплению ионов Са2+в клетке.
Накопившиеся в клетке ионы Са2+ стимулируют рианодиновые рецепторы СПР и активируют выход ионов Са2+ из депо в цитоплазму.
Ионы Са2+связывают тропонин С и устраняют тормозное влияение тропонин-тропомиозинового комплекса на взаимодействие актина и миозина.
Взаимодействие актина и миозина ведет к сокращению кардиомиоцита.
Эффекты
Положительный ионотропный эффект (нарушение работы Na+/K+-АТФазы)
Отрицательный хронотропный эффект (активация вагуса)
Затруднение AV-проводимости – отрицательный дромотропный эффект (активация вагуса + прямое угентающее действие)
Повышение автоматизма волокон Пуркинье (снижение концентрации К+ в цитоплазме)

Потенциал-зависимые красители
Быстрые красители
Действие быстрых (как правило, стирилпиридиновые красители, например Di-4-ANEPPS, RH 237 и др.) основано на изменении их электронной структуры и, следовательно, их флуоресцентные свойства изменяются при изменении электрического поля. Их оптический отклик происходит достаточно быстро, чтобы обнаружить быстрые изменения мембранного потенциала (миллисекунды), происходящие в возбудимых клетках, в том числе в отдельных нейронах, кардиомиоцитах или при исследовании целого мозга.
Тем не менее, степень изменения интенсивности флуоресценции у таких
красителей часто достаточно низкая; обычно изменение интенсивности составляет 2-10% от исходного уровня флуоресценции при изменении трансмембранного потенциала на 100 мВ. Это накладывает определенные ограничения на их использование.

Медленные красители
Действие медленных красителей (Slow-Response) (к ним относятся красители DiOC2, JC-1, JC-9, Oxonol V, Merocyanine 540 и др.) изменениях в их трансмембранном распределения при гипер- или деполяризации мембраны, которое сопровождаются изменением интенсивности флуоресценции. Величина их оптического ответа гораздо больше, чем у быстродействующих потенциал-зависимых красителей (как правило, интенсивность флуоресценции изменяется на 1% при изменении трансмембранного потенциала на 1 мВ). К медленным потенциал-зависимым красителям относятся катионные карбоцианины и родамины и анионные оксонолы, предназначенные для выявления изменений потенциалов мембраны невозбудимых клеток, вызванных изменениями дыхательной деятельности, проницаемости ионных каналов, фармакологическими воздействиями обязательным и другими факторами.