Автоматизация

Практическое применение ИФА
• массовой диагностики инфекционных заболеваний (выявление различных специфических антигенов или антител к ним);
• выявления и определения уровня гормонов и лекарственных препаратов в биологических образцах;
• определения изотипов (IgG, IgM и другие) антител против конкретного антигена;
• выявления иммунных комплексов;
• выявления онкомаркеров;
• определения белков сыворотки крови (ферритин, фибронектин и др.);
• определения общего IgE и специфических IgE антител;
• скрининга моноклональных антител;
• определения цитокинов в биологических жидкостях.

Стадии ИФА
1. стадия узнавания тестируемого соединения специфическим к нему антителом, что ведет к образованию иммунного комплекса;
2. стадия формирования связи конъюгата с иммунным комплексом или со свободными местами связывания;
3. стадия превращения ферментной метки в регистрируемый сигнал.

Классификация ИФА
По типу реагентов, присутствующих на первой стадии ИФА, различают конкурентный и неконкурентный методы
А) В конкурентном ИФА на первой стадии в системе присутствуют одновременно анализируемое соединение и его аналог, меченный ферментном и конкурирующий за центры специфического связывания с ним.
Б) Для неконкурентных методов характерно присутствие в системе на первой стадии только анализируемого соединения и специфичных к нему центров связывания.

Все методы ИФА делются на гомогенные и гетерогенные.
Если все три стадии ИФА проходят в растворе и между основными стадиями нет дополнительных этапов разделения образовавшихся иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов, метод относится к группе гомогенных.
Для гетерогенных методом характерно проведение анализа в двухфазной системе с участием твердой фазы – носителя

По принципу определения тестируемого вещества
Прямое определение концентрации вещества (антигена или антитела) по числу провзаимодействующих с ним центров связывания. В этом случае ферментная метка будет находиться в образовавшемся специфическом комплексе АГ-АТ. Концентрация определяемого вещества будет прямо пропорциональна регистрируемому сигналу
Определение концентрации вещества по разности общего числа мест связывания и оставшихся свободными центров связывания. Концентрация определяемого вещества при этом будет возрастать, а регистрируемый сигнал снижаться, следовательно, в данном случае прослеживается обратная зависимость от величины регистрируемого сигнала

Компоненты в ИФА
Ферменты. Ферментные метки обладают чрезвычайно мощным каталитическим действием, одна молекула фермента может реагировать с большим количеством молекул субстрата.

Ферменты и их субстраты наиболее широко используемые в ИФА

Антигены и антитела.
АГ и AT, используемые в ИФА, должны быть высокоочишенными и высокоактивными.

Конъюгат
Конъюгат – это антиген или антитело, меченные ферментной меткой. Образование коньюгата – один из важных этапов проведения ИФА.

Твердая фаза
. В качестве твердой фазы для проведения ИФА можно применять различные материалы: полистирол, поливинилхлорид, полипропилен и другие вещества. Твердой фазой могут служить стенки пробирки, 96-луночные и др. планшеты, шарики, бусины, а также нитроцеллюлозные и другие мембраны, активно сорбирующие белки

Варианты постановки ИФА
Общий принцип твердофазного ИФА.
1. На 1 этапе реакции адсорбируют антигены или антитела на твердой фазе. При этом не связавшиеся с твердой фазой реагенты легко удаляются отмыванием.

2. В сенсибилизированных лунках инкубируют исследуемый образец. В лунках с положительным контролем – стандартные реагенты. При этом на поверхности твердой фазы формируются иммунные комплексы. Несвязавшиеся компоненты удаляют отмыванием.

3. При добавлении конъюгата антитело-фермент или антиген-фермент и связывании его с иммобилизованным иммунным комплексом активный центр фермента остается доступным для последующего взаимодействия с субстратом. Инкубация субстрата в лунках с иммобилизованным конъюгатом приводит к развитию цветной реакции. Эту реакцию можно остановить на нужной стадии, выраженность окрашивания можно оценить визуально или по оптической плотности.

Прямой ИФА

Непрямой ИФА (сендвичевый)

Конкурентный ИФА

Чувствительность метода
Средняя чувствительность ИФА
10-9 – 10-12 моль.

Обработка сигналов: цифровая фильтрация
Теоретическая форма сигнала прямоугольной формы (а) и экспериментальный зашумленный сигнал (б).

Аналоговые и цифровые фильтры
При обработке аналитических данных, представленных в виде некоторой непрерывной зависимости — спектров, хроматограмм и т.д. — возникают следующие основные задачи.
• Увеличение интенсивности полезного сигнала по сравнению с
шумами.
• Дифференцирование данных с целью подавления сигнала фона
и улучшения разрешения пиков.
• Интегрирование данных для нахождения площади пиков.

Фильт скользящего среднего
При ширине фильтра 2m + 1 точек исходные данные уk заменяются средними
j=-m
yk' = 1/(2m+1) ∑ yk+j
j=-m
где k — индекс обрабатываемого значения, 2m + 1 — число данных, используемых для усреднения (ширина фильтра)

Сглаживание данных при помощи различных цифровых фильтров. 1 — скользящее среднее, 5 точек; 2 — скользящее среднее, 11 точек; 3 — фильтр Савицкого-Голея, 5 точек; 4 — интерполяционный фильтр.

Фильтр Савицкого-Голея
При ширине фильтра 2m+1 точек средние значения равны
j=-m
yk' = 1/NORM ∑ cjyk+j (11)
j=-m
Весовые коэффициенты cj для фильтров различной ширины табулированы

Дифференцирование и интегрирование данных
Фильтр Савицкого-Голея может быть использован и для дифференцирования или интегрирования данных. Для этого следует лишь соответствующим образом выбрать весовые коэффициенты. Численные методы дифференцирования и интегрирования сигналов широко применяются в стандартном математическом обеспечении аналитических приборов.
Дифференцирование позволяет устранить постоянный сигнал фона и улучшить разрешение пиков. Интегрирование пиков необходимо для нахождения их площади в количественном анализе.

Фурье-преобразование
Принцип фурье-преобразования. Суммарный сигнал (а) состоит (б) из двух синусоид с периодами t1 = 1 с и t2 = 1/3 с, (в) — этот же спектр, представленный в виде зависимости интенсивности от частоты.