Центр коллективного пользования«Биология живой клетки и биомедицинские нанотранспортеры лекарств»Институт биологии гена РАН

Основные направления исследований ЦКП:
Регуляция работы гена и структура хроматина, функциональная геномика и биоинформатика.
Молекулярная медицина, генотерапия, стволовые клетки, клеточная терапия, биотерапия опухолей.
Структура и функционирование клетки, межклеточные взаимодействия, молекулярные основы клеточной дифференцировки, иммунитета и онкогенеза.
Генная и белковая инженерия, трансгеноз
Проведение комплекса нанобиомедицинских исследований

Приборная база и перечень услуг, оказываемых ЦКП ИБГ РАН
Прибор для исследований методом поверхностно- плазмонного резонанса Biacore X
* Расчет кинетических констант взаимодействий молекул.
* Определение концентрации веществ в сильно разбавленных растворах
* «Вылавливание» («fishing») веществ для дальнейшего анализа.
Спектрофотометр NanoDrop ND-8000.
Спектрофотометр позволяет проводить измерение до 8 образцов одновременно.
* Определение концентрации и чистоты нуклеиновых кислот.
* Количественный анализ протеинов, коньюгатов, метало-протеинов.
* Анализ белков методами Бредфорд, Лоури.
* Измерение плотности клеток в суспензии.
* Определение интенсивности флюоресценции при связывании метки с нуклеиновыми кислотами в биочипах.

Атомно-силовой микроскоп с контроллером Nanoscope III A
* Определение топографии поверхности образца с атомным разрешением ~1 Ǻ по оси z и ~1 нм в плоскости xy (зависит от используемого зонда). Максимальная область сканирования 150×150 мкм в плоскости xy и 6 мкм по оси z. Изучаемая поверхность может контактировать как с воздухом, так и с жидкой фазой.
* Определение силы взаимодействия между зондом и образцом. При этом, возможна модификация зонда специфическими биомолекулами (например, антителами). Минимальная достоверно измеряемая сила взаимодействия 30 пН.

Оборудование для трансфекции Nucleofector.
Осуществление высокоэффективной доставки генетического материала в большое число различных по происхождению клеток:
* Получение стабильных клеточных линий-продуцентов целевых белков на основе линий клеток CHO-K1, SF+, Pichia methanolica.
* Изучение активностей регуляторных элементов генома в клеточных линиях человека, мыши, курицы, дрозофилы.
* Выключение экспрессии целевого гена при помощи siRNA.
* Модифицирование первичных культур клеток человека, мыши для направленного изменения свойств клеток.

Проточный цитометр — сортер Epics Altra
* Определение жизнеспособности клеток, содержания ДНК в клетке, определение фагоцитарной активности, определение внутриклеточных цитокинов.
* Анализ уровня экспрессии репортерных генов в клетках.
* Сортировка клеток по любым определяемым параметрам.
ZetaPALS
* Определение с помощью метода динамического светорассеяния гидродинамического радиуса наночастиц в пределах от 0,6 нм до 6 мкм;.
* Определение дзета-потенциала наночастиц в пределах 6 мкВ до 100 мВ при рН от 1 до 13, при температуре от 6 °С до 100 °С и при электропроводности от 0 до 20 Си/м. Типичная длительность измерения – 30 с.

Приборы ПЦР в реальном времени CFX-96 (BioRad) и StepOne Plus (Applied Biosystems)
* Генотипирование организмов, идентификации аллелей (вариантов) генов.
* Геномная дактилоскопия (идентификация индивидуальных организмов, в частности для целей судмедэкспертизы).
* Обратная транскрипция (конвертация РНК в ДНК).
* Идентификация ДНК возбудителей заболеваний бактериальной и вирусной, паразитарной природы в пробе.
* Генотипирование вариантов генов (в частности анализ антибиотикоустойчивости микроорганизмов, анализ предрасположенности к заболеваниям).
* Анализ хромосомных нарушений (в частности при онкогенезе, в пренатальной диагностике, и др.).
* Анализ экспрессии генов.
* Установление титра возбудителей в пробе (количественная диагностика вирусов и др. инфекционных агентов в пробе).
* Определение генно-модифицированных организмов и содержания ГМО в пробах.
* Оптимизация условий проведения ПЦР для праймеров клиента.
* Анализ и обнаружение наличия мутаций (в т.ч. SNP).

Мультифотонный микроскоп LSM 510 META NLO
* Анализ распределения и интенсивности флуоресценции в фокальной плоскости и по объему в биологических образцах (клетках и тканях) в диапазонах длин волн:
в конфокальном режиме – от 458 нм до 633 нм;
в мультифотонном режиме – в соответствии с диапазоном ИК-лазера (710 – 990 нм);
* Определение характеристических времен затухания флуоресценции в изучаемом образце;
* Анализ изображений в режиме FLIM (fluorescence lifetime image microscopy - флуоресцентная микроскопия в реальном времени, дающая возможность определять характеристики затухания флуоресценции);
* Анализ методом FRAP;
* Определение колокализации флуоресцентных молекул как по наложению «красок», так и по данным FRET (флуоресцентного резонансного переноса энергии).

Фосфоимиджер Cyclone Storage Phosphor Screen
Определение распределения радиоактивного зонда в образцах, пришитых к найлоновым и нитроцеллюлозным мембранам:
1. Анализ полиморфных локусов в геноме
2. Количественное определение повторяющихся участков генома
3. Анализ уровня экспрессии генов
4. Характеристика длины и структуры транскриптов
5. Определение участков связывания для ДНК- и РНК-связывающих белков.
Конфокальный микроскоп Leica TCS SP2
* Измерение распределения интенсивности флуоресценции в фокальной плоскости и по объему исследуемых образцов при разных длинах волн в диапазоне длин волн возбуждения флуоресценции 450 – 663 нм (до семи независимых каналов регистрации одновременно).
* Получение трехмерных изображений флуоресцентно меченных препаратов с измерением геометрических параметров.
* Математическая обработка изображений.
* Анализ процессов методами FRET и FRAP
* Определение колокализации флуорофоров в образце.

Прибор рассчитан на использование различных микропланшетов (6- 12- 24- 48- 60- 72- 96- 384- 1536- луночные планшеты различных производителей). Прибор оборудован двумя поршневыми диспенсерами для внесения реагентов (объем впрыска 5-1000 мкл), системами для термостатирования (4°C - 50°C ± 0.5°C) и встряхивания микропланшета.
Универсальный микропланшетный ридер Synergy 4.
Модульная изменяемая архитектура ридера позволяет определять:
* интенсивность флюоресценции;
* флюоресценцию с временным разрешением;
* поляризацию флюоресценции;
* быстро (flash-) и медленно (glow-) протекающую люминесценцию;
* поглощение в УФ и видимой области спектра;
* FRET (исследование резонансного переноса энергии флюоресценции);
* TR-FRET (исследование резонансного переноса энергии флюоресценции с временным разрешением);
* BRET (исследование резонансного переноса энергии биолюминесценции);
* спектральное сканирование.

Наиболее значимые результаты,
полученные с использованием научного оборудования ЦКП:
Спроектированы и синтезированы 6 простых модулей искусственных регуляторных элементов (СИ-элементы) и тест-системы для их тестирования; проведено генно-инженерное клонирование разработанных конструкций в культурах клеток млекопитающих; испытана эффективность использования СИ-элементов в трансгенных мышах; проведена поисковая работа по выяснению механизмов функционирования инсуляторов, защищающих трансген от действия окружающих негативных и позитивных регуляторных элементов.
Создан новый модульный рекомбинантный транспортер DTox-HMP-СЯЛ-ЭФР для доставки лекарственных агентов в опухолевые клетки с повышенной экспрессией рецепторов erbB1, что к настоящему времени выявлено в опухолях человека, имеющих различное происхождения (карциномы различной локализации, глиомы и многие другие).
В исследованиях по разработке генодиагностики и генотерапии рака определена экспрессия 15 антигенов, принадлежащих к различным семействам и 3 -дифференцировочных антигенов меланомы, проанализирован белок HLA-Е, выделенный из лизатов клеток меланомы: показана экспрессия мРНК и локализация данного белка; в процессе исследований разработана методика выделения клеток меланомы кожи из тканевых образцов, проведена первичная характеристика опухолевых клеток и анализ антигенной специфичности выделенных опухолевых клеток.

Наиболее значимые результаты,
полученные с использованием научного оборудования ЦКП:
Приведено научное обоснование создания средств блокирования биологической функций ФРЭС (фактор роста эндотелия сосудов) с целью контроля за патологическим неоангиогенезом при нарушениях зрения, аутоиммунных заболеваниях и злокачественных опухолях; показано, что стратегия блокирования функций ФРЭС с помощью антител является наиболее перспективной; получены наноантитела к ФРЕС; изучена специфическая активность субстанции наноантител к ФРЭС на модельных животных in vivo.
Разработаны модельные тест-системы in vitro для определения влияния компонентов сырья растительного на пролиферацию опухолевых клеток в культуре.
Разработаны модельные тест-системы in vitro для определения влияния компонентов жирных кислот гидробионтов (ЖКГ) на пролиферацию опухолевых клеток в культуре.
Показана возможность использования семейства генов tag7-tagL в целях разработки новых подходов к терапии рака.