Гибридомная технология

опухоли

Биологические “следы”
чужеродных объектов
ПЦР – полимеразная цепная реакция

Биологические “следы” чужеродных объектов
Белки (антигены)

Белки (антитела)
“Встреча” в организме человека ВИЧ и антител, специфичных к нему.

реакции агглютинации (определения групп крови);
реакция коагглютинаци;и
реакция торможения гемагглютинации (РТГА);
реакция преципитации;
реакция двойной иммунодиффузии;
реакция радиальной иммунодиффузии;
иммуноэлектрофорез;
реакция флоккуляции
(токсин + антитоксин);
9. иммунная электронная микроскопия;
10. реакция связывания комплемента (РСК);
11. реакция нейтрализации;
12. иммуноферментный метод, или анализ (ИФА)
На принципе реакции антигена с антителом in vivo основаны методы выявления антигенов или специфичных к ним антител in vitro.
“Встреча” в организме (in vivo) ВИЧ и антител, специфичных к нему.
“Встреча” в пробирке (in vitro) антигена и антитела, специфичного к нему.

Реакция антигена с антителом - специфическая
реакция in vitro.

ИФА тест-системы производства ЗАО “Вектор-Бест”:
** - ИФА –тесты на выявление антител (IgG и IgM) и антигенов; * - выявление только антигенов.

Аденовирус-антиген–ИФА–БЕСТ
Рубелла-IgM-ИФА-Бест

Моноклональное антитело – это молекула иммуноглобулина (гликопротеина), паратоп вариабельной области которого строго специфичен к эпитопу другого протеина (как ключ к замку).

Иммуноблоттинг белков ВИЧ с сыворотками больных

Капсид зрелого вириона ВИЧ состоит из 2000 молекул белка р24.
Молекула белка р24 состоит из 250 а.к.
Эпитоп для одного антитела обычно состоит из 3 - 10 а.к.

Аффинность – прочность (энергия) связи одного антиген-связывающего центра антитела с индивидуальным эпитопом антигена.
Авидность - суммарная сила взаимодействия антитела с антигеном и определяется аффинностью антител и числом антиген-связывающих центров.

Kohler G. and Milstein C., (Кембридж) в работе «Длительно живущие культуры гибридных клеток, секретирующие антитела предопределенной специфичности», Nature, 1975г. предложили метод создания иммортализованной (бессмертной) линии клеток, продуцирующих антитела одной специфичности, путем слияния нормальных лимфоцитов иммунизированных животных с клетками опухоли.
-ГФТФ
В 1984 г. за открытие принципа получения моноклональных антител авторы получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине.

Рисунок из (Ройт А. Иммунология. 2000)

Этапы гибридомной технологии.
Цель получения МКА в препаративном количестве:
- картирование антигенных эпитопов исследуемого патогена
Рис. Схема гликопротеина Е TBEV с картироваными эпитопами кросс-реактивности среди флавивирусов
в пределах II домена и тип-, субтип- специфическими эпитопами в пределах I и III доменов белка Е
(Mandl CMandl C.Mandl C.W. et al., 1989).

моноклональные антитела для обнаружения
исследуемого патогена в тканях (клетках)
лабораторных животных или в культуре
инфицированных клеток
Выявление белка рр65 цитомегаловируса в инфицированных клетках Vero иммуноцитохимическим окрашиванием с использованием мышиных МКА 5F10 и конъюгатом антивидовых антител с пероксидазой. Субстрат для пероксидазы 3-avino-9- ethelcarbazol.

Моноклональные антитела для диагностики
(разработка тест-системы ИФА или ИХА)

моноклональные
антитела для получения
терапевтических препаратов

Этапы гибридомной технологии.
2. Выбор и подготовка антигена для иммунизации
животных с целью получения моноклональных антител.
Антигены – любая органическая субстанция,
способная вызвать иммунный ответ
(цельные объекты или их отдельные белки;
природные или рекомбинантные белки).
опухоли
наркотики
цитокины
антитела

Подготовка антигена для иммунизации

Иммуноблоттинг белков ВИЧ с сыворотками больных
Тест антигена на антигенность- --
- способность узнавать специфические антитела in vitro

Этапы гибридомной технологии.
3. Иммунизация.
Иммуногенность – способность антигена in vivo вызывать иммунный ответ, т.е. синтез антител (иммуноглобулинов).
лимфоцит

Основное свойство большинства адъювантов - способность их депонировать антиген в липосомах, т. е. адсорбировать его на своей поверхности и длительное время сохранять в организме, что увеличивает продолжительность его влияния на иммунную систему.
Неполный адъювант Фрейнда - водно-жировая эмульсия, содержащая вазелиновое маслоНеполный адъювант Фрейнда - водно-жировая эмульсия, содержащая вазелиновое масло, ланолинНеполный адъювант Фрейнда - водно-жировая эмульсия, содержащая вазелиновое масло, ланолин и эмульгаторНеполный адъювант Фрейнда - водно-жировая эмульсия, содержащая вазелиновое масло, ланолин и эмульгатор. Депонирует антиген и усиливает его захват фагоцитами.
Полный адъювант Фрейнда - включает в себя, кроме вышеперечисленных компонентов, БЦЖПолный адъювант Фрейнда - включает в себя, кроме вышеперечисленных компонентов, БЦЖ. Это позволяет ему дополнительно активировать макрофаги и костимулировать Т-клетки.

Миеломные клетки с
мутацией в гене
гипоксантин-
фосфорибозилтрансферазы (ГФТФ)
Этапы гибридомной технологии.
4. Подготовка популяции
миеломных клеток-реципиентов к слиянию селекцией в среде, содержащей 8-азагуанин – токсичный аналог ГФТФ, для гибели ревертантов, содержащих ген ГФТФ.
Используют перевиваемые миеломные В-клетки от мышей той же линии, не секретирующими собственных антител. Лимфоцит и миелома, взятые от одного вида животного инбредной линии, имеют сходный репертуар антигенов гистосовместимости на клеточной поверхности.

Миеломные клетки с мутацией в гене гипоксантин-фосфорибозилтрансферазы (ГФТФ)
Лимфоциты из селезенки
иммунизированной
мыши инбредной линии Balb/c
Полиэтиленгликоль
полимерполимер этиленгликоля HO−(CH2−CH2−O)n−H – сливающий агент
Этапы гибридомной технологии.
5. Гибридизация – слияние миеломных клеток с лимфоцитами мыши –донора селезенки под действием полиэтиленгликоля с м.м. 1300-1600.

Соотношение клеток для слияния (1/3) - 20 млн. миеломных клеток (один культуральный флакон 175 см3) на 60 млн. лимфоцитов (одна селезенка).
Из 10 тысяч клеток сливается одна пара – это хороший результат.
Посев - 1 млн. участвовавших в слиянии клеток на один 96-луночный планшет (10 тыс. клеток в лунку с предварительно посаженными в лунки перитониальными макрофагами мыши для зачистки погибших неслившихся миеломных и лимфотических клеток.
Селекция гибридом
с аминоптерином
После слияния клетки в течение 10-14 дней поддерживают в среде, содержащей НАТ (гипоксантин, аминоптерин и тимидин).

Этапы гибридомной технологии.
6. Клонирование слившихся клеток - -
- посев одной гибридной клетки в одну лунку.
3-кратное тестирование ростовой среды от каждой колонии в ИФА на антигене, которым иммунизировали мышь. Дальнейший рассев только положительных колоний, выросших из одной клетки.

Этапы гибридомной технологии.
7. Выращивание отдельных клонов клеток в массовой культуре и заморозка клеток из первичных клонов.
8. Внутрибрюшинное прививание гибридомных клеток мышам инбредной линии Balb/c
(1 - 2 млн клеток на мышь).
1 до 60 мкг/мл

Этапы гибридомной технологии.
9. Очистка моноклональных антител
из асцитической жидкости мышей.
Асцитная жидкость содержит гомогенные моноклональные антитела в высокой концентрации (1 – 10 мг/мл) . Для очистки антител применяется фракционирование сульфатом аммония. Последующая ионообменная хроматография обеспечивает чистоту антител на уровне только 90 %, поэтому для дальнейшей очистки необходимо использовать дополнительные методы, например гель-фильтрацию. В настоящее время большее распространение получил метод очистки антител с помощью аффинной хроматографии на иммобилизованном белке А или белке G. Этот метод очистки более быстрый (одностадийный) и позволяет получать антитела с чистотой более 95 %.
1 – 10 мг/мл

Стерильный бокс для работ по получению
гибридных клеточных линий
СО2-инкубатор
370С
ламинар

Камера для электрофореза
с источником тока
Камера для переноса белков с геля на нитроцеллюлозную мембрану
Автоматические пипетки – дозаторы и насадки к ним

Планшетный анализатор для ИФА
Световой микроскоп

Бокс биологической безопасности III класса “крокодил” для работы с особо опасными патогенами.

2 часть. Моноклональные антитела как инструмент
исследования антигенной структуры
вирусов Марбург и Эбола
(семейство Filoviridae - от лат. filum – нить).

Случаи лихорадки Марбург

Процентное содержание белков в вирионе:
GP - 4, 7%;
VP40 – 37,7 %;
VP35 – 24,5 %;
NP – 17 %
VP24 – 7,5 %;
VP30 – 6,6 %;
L – 2 %;
(Elliot L.H. et al., 1985).
(Рисунок из статьи Ndayimirije N, Kindhauser M., 2005).
Филоментозные частицы длиной 790 нм вирус Марбург, 970 нм вирус Эбола,
диаметр частиц 80 нм. Геном – несегментированная одноцепочечная негативная РНК (1,1 % от массы вириона)

Volchkov V. et al., 1998)
Сливающий и иммуносупрес-сивный домены
sGP

При филовирусных инфекциях развивается виремия - в это время количество вирусных частиц в крови 106 -109 в мл.
Летальный исход может наступить на 5-8 сутки от обезвоживания, кровопотери и шока.
Защитные антитела появляются через 7 дней от начала болезни.
Процентное содержание белков в вирионе:
GP - 4, 7%;
VP40 – 37,7 %;
VP35 – 24,5 %;
NP – 17 %
VP24 – 7,5 %;
VP30 – 6,6 %;
L – 2 %;
(Elliot L.H. et al., 1985).

Название: Эпидемия
Оригинальное название: Outbreak
Страна: США
Год выпуска: 1995
Жанр: триллер, боевик
Режиссер: Вольфганг Пeтерсен
В ролях: Дастин Хоффман, Рене Руссо, Морган Фриман, Кевин Спейси, Кьюба Гудинг мл., Дональд Сазерленд
Описание: Из Африки в Америку с зараженной обезьянкой попадает смертельный вирус. Специалисты-эпидемиологи из НИИ инфекционных заболеваний армии США, в числе которых полковник Сэм Дэниелс, срочно вылетают в эпицентр заражения. Двое из высших военных руководителей — начальники Сэма — скрывают от него, что им известен этот вирус, который они выводили несколько лет. И, более того, даже разработали сыворотку, способную обезвредить вирус. Для предотвращения страшной эпидемии нужна сыворотка, которую можно получить лишь из крови первоначального носителя — той самой обезьянки. Дело осложняется тем, что место ее нахождения неизвестно, а счет идет на часы……………………………..

Пущинский научный центр РАН. Серпуховской район Московской области
ФБУН ГНЦ ВБ “Вектор”
Наукоград Кольцово, Новосибирская область
Научные центры изучения филовирусов в России.
Получение IgG лошадей
для профилактики и лечения.
Разработка инактивированных вакцин.

Иммуноблоттинг. Выявление белков вируса Марбург (ВМ-3) антителами сыворотки крови реконвалесцента (1990 г.).
1 – нормальная сыворотка крови человека в разведении 1/1000;
2 – сыворотка крови человека, переболевшего геморрагической лихорадкой Марбург (Никифоров В.В. и др., 1994), в разведении 1/1000;
Стрелками обозначено местоположение белков вируса Марбург на нитроцеллюлозной мембране.
ВМ-1 ВМ-2 ВМ-3
Процентное содержание белков в вирионе:
GP - 4, 7%;
VP40 – 37,7 %;
VP35 – 24,5 %;
NP – 17 %
VP24 – 7,5 %;
VP30 – 6,6 %;
L – 2 %;
(Elliot L.H. et al., 1985).

Определение специфичности взаимодействия инактивированных
антигенов вируса Марбург с сывороткой крови реконвалесцента.
Концентрация антигенов 200 нг/лунка.
Инактивация ВМ-3: - 0,17% димера этиленимина 24 ч при комнатной температуре и прогреванием при 60 0 С в течение часа.
Сыворотку крови использовали в разведении 1/500.

Инактивация вируса Эбола:
кипячение 2 мин в растворе,
Содержащем 5 % меркаптоэтанола и 1% SDS,
с дальнейшим прогревание при 600 С в течение часа.
Процентное содержание белков в вирионе:
GP - 4, 7%;
VP40 – 37,7 %;
VP35 – 24,5 %;
NP – 17 %
VP24 – 7,5 %;
VP30 – 6,6 %;
L – 2 %;
(Elliot L.H. et al., 1985).

Иммуноблоттинг. Выявление белков вируса Марбург для перекрестного взаимодействия антител, специфичных к вирусу Эбола.
1, 2 – белки очищенных концентрированных препаратов вирусов Марбург и Эбола, перенесенные после электрофореза на нитроцеллюлозную мембрану, окрашены амидочерным; обозначено местоположение белков NP, VP40, VP35, VP30 и VP24 филовирусов.
3 - иммуноблоттинг белков вируса Марбург с АС мыши (№ 1), иммунизированной вирусом Эбола;
4 – иммуноблоттинг белков вируса Эбола с АС мыши (№ 1), иммунизированной вирусом Эбола;
5 – иммуноблоттинг белков вируса Марбург с нормальной сывороткой крови мыши;
все антитела использовали в разведении (1/300);
Стрелками показаны белки для перекрестной активности антител, специфичных к инактивированному вирусу Эбола, с белками NP и VP35 инактивированного вируса Марбург.

Таблица 1. Исследование спектра белков-иммуногенов вируса Марбург
Примечание: инакт. – инактивированный вирусный препарат; инф. – инфекционный вирус;
*- сыворотки от выживших морских свинок, инфицированных вирусом Марбург (условное обозначение каждого животного);
человек переболел лихорадкой Марбург при заражении во время лабораторной аварии (Никифоров В.В. и др., 1994); нормальные сыворотки - мыши, кролика, лошади, морской свинки и человека использовались в качестве отрицательного контроля.
Выделены мажорные полосы, соответствуюшие данным вирусным белкам. Перекрестное взаимодействие антител с вирусом Эбола.

Таблица 2. Исследование спектра белков-иммуногенов вируса Эбола
Примечание: инакт. – инактивированный вирусный препарат; инф. – инфекционный вирус;
нормальные сыворотки - мыши, кролика, крысы, лошади, морской свинки использовались в качестве отриц. контроля.
Выделены мажорные полосы соответствуюшие данным вирусным белкам.
Перекрестное взаимодействие антител с вирусом Марбург

Для наработки филовирусных антигенов необходим
4 уровень биозащиты,
так как они относятся к I группе патогенности.
Альтернативой использованию вирусных препаратов может быть применение
препаратов рекомбинантных белков,
имеющих антигенные эпитопы, соответствующие
антигенным эпитопам вирусных белков.

Схематическое изображение рекомбинантной плазмиды pQE30-VP40ВЭ
Электрофореграмма: экспрессия гена VP40 вируса Эбола в клетках E.coli

Характеристики рекомбинантных белков вируса Марбург.
Примечание: a рекомбинантные белки были очищены, используя Ni-NTA хроматографию (QIAGEN), разделены в 12% ПААГ-ЭФ и визуализированы окрашиванием с Кумасси синим; b определяли путем компьютерного анализа аминокислотной последовательности рекомбинантных белков.

Таблица 3. Использование рекомбинантных белков в качестве антигена в ТИФА
для выявления IgG, специфичных к вирусу Марбург
Примечание: ТИФА – твердофазный иммуноферментный анализ;
ЧС – сыворотка человека, переболевшего геморрагической лихорадкой Марбург (в скобках указана дата забора крови); IgG – очищенные IgG лошадей, иммунизированных инфекционным вирусом Марбург (ВЦ НИИМ МО РФ, г. С. Посад);
МАС – мышиные антисыворотки;
PQE – лизат E.coli (отрицательный контроль для рекомбинантных белков); проводили обработку (истощение) исследуемых моноспецифических сывороток в присутствии 1 % -го раствора лизата E.coli клеток 20 мин при 37 0 С;
** – в качестве отрицательного контроля использовали нормальные сыворотки человека (5 сывороток), лошади (1 сыворотка), мыши (5 сывороток);
*** – смесь рекомбинантных белков GP, NP, VP35, VP40 по 100 нг/лунку каждого.

Электрофореграмма очищенных вирусов Марбург, Эбола
и рекомбинантных филовирусных белков
1. рекомбинантный белок VP35 вируса Марбург (5 мкл);
2. рекомбинантный белок VP40 вируса Марбург (5 мкл);
3. препарат инактивированного вируса Марбург (10 мкл);
4. препарат инактивированного вируса Эбола (10 мкл);
5. рекомбинантный белок VP40 вируса Эбола (5 мкл);
6. рекомбинантный нуклеопротеин вируса Эбола( 5 мкл);
7. белковые маркеры молекулярного веса (10 мкл), (Bio-Rad).
Рекомбинантные белки получены в экспрессионной системе E.coli. Качко А.В., Ивановой А.В., Сорокиным А.В.
Инактивированый вирус Марбург любезно предоставлен доктором Белановым Е.Ф.
Инактивированый вирус Эбола любезно предоставлен доктором Чепурновым А.А.
Белки VP35 вируса Эбола

Таблица 5. Исследование иммунохимических свойств и перекрестной активности МКА
с гетерологичными вирусными и рекомбинантными белками
Примечания: NP (?) – белок –мишень не определяется в иммуноблоттинге;
нет реакции в данном методе;
концентрация антигенов - 100 нг/лунка ;
Вирус Эбола и его рек.белки - гетерологичные антигены для исследования перекрестной активности МКА.

Таблица 5 (продолжение). Исследование иммунохимических свойств и перекрестной активности МКА с гетерологичными вирусными и рекомбинантными белками
Примечания: ВЭ-IS – исходный штамм ВЭ-Заир;
8МС – штамм ВЭ-Заир, адаптированный к морским свинкам, на 8 пассаже вызвал гибель животных (Volchkov V.E. et al., 2000) ;
МКА 7B11* - продукт секреции гибридомы крысиного происхождения (автор гибридомы доктор Перебоев А.В.);
нет реакции в данном методе; концентрация антигенов 100 нг/лунка .
Вирус Марбург и его рек. белки – гетерологичные антигены для исследования перекрестной активности МКА.

Иммуноблоттинг нативных и рекомбинантных белков вирусов Марбург и Эбола с моноклональными антителами а. 1 2 3 4 b. 1 2 3 4 5 6 7 8
а.
все полоски мебраны обработаны препаратом очищенных МКА 3F9 в разведении 1/500;
1 – препарат вируса Марбург;
2 - препарат вируса Эбола (отриц. контроль на антиген);
3 – лизат E.coli (отриц. котроль для рекомбинантного белка);
4 – очищенный рекомбинантный белок VP35.
b.
1 - препарат вируса Марбург обработан МКА 7Н10 в разведении 1/500;
2 - препарат вируса Марбург обработан МКА 7D8 в разведении 1/500;
3 - рекомбинантный белок VP40 обработан МКА 7Н10 в разведении 1/500;
4 - рекомбинантный белок VP40 обработан МКА 7D8 в разведении 1/500;
5 - препарат вируса Эбола обработан МКА 7Н10 в разведении 1/500 (отриц. контроль);
6 - препарат вируса Эбола обработан МКА 7D8 в разведении 1/500 (отриц. контроль);
7 - лизат E.coli обработан МКА 7Н10 в разведении 1/500 (отриц. контроль);
8 - лизат E.coli обработан МКА 7D8 в разведении 1/500 (отриц. контроль).

c. 1 2 3 4 5 6 7 8 d. 1 2 3 4 5 6 7 8
Иммуноблоттинг нативных и рекомбинантных белков вирусов Марбург и Эбола с моноклональными антителами
c.
1 - препарат вируса Эбола обработан МКА 4А2 в разведении 1/10000;
2 - препарат вируса Эбола обработан МКА 1С1 в разведении 1/10000;
3 - рекомбинантный белок VP40 обработан МКА 4А2 в разведении 1/10000;
4 - рекомбинантный белок VP40 обработан МКА 1С1 в разведении 1/10000;
5 - препарат вируса Марбург обработан МКА 4А2 в разведении 1/10000 (отриц. контроль);
6 - препарат вируса Марбург обработан МКА 1С1 в разведении 1/10000 (отриц. контроль);
7 - лизат E.coli обработан МКА 4А2 в разведении 1/10000 (отриц. контроль);
8 - лизат E.coli обработан МКА 1С1 в разведении 1/10000 (отриц. контроль).
d.
1 - препарат вируса Эбола обработан МКА 1В2 в разведении 1/500;
2 - препарат вируса Эбола обработан МКА 7В11 в разведении 1/500;
3 - рекомбинантный NP обработан МКА 1В2 в разведении 1/500;
4 - рекомбинантный NP обработан МКА 7В11 в разведении 1/500;
5 - препарат вируса Марбург обработан МКА 1В2 в разведении 1/500 (отриц. контроль);
6 - препарат вируса Марбург обработан МКА 7В11 в разведении 1/500 (отриц. контроль);
7 - лизат E.coli обработан МКА 1В2 в разведении 1/500 (отриц. контроль);
8 - лизат E.coli обработан МКА7В11 в разведении 1/500 (отриц. контроль).

Эпитопное картирование белков на основе результатов конкурентного ИФА и биологических свойств МКА с инфекционным вирусом Марбург
A – эпитопы нуклепротеина обозначены квадратами;
B – эпитопы белка VP35 обозначены кругами;
C – эпитопы белка VP40 обозначены треугольниками;
Эпитопы для МКА, вызывающих лизис инфицированных вирусом Марбург клеток Vero, выделены темным цветом;
D – функциональный участок, состоящий из эпитопов трех белков, вызывающих индукцию МКА, участвующих в АЗКОЛК.

Схема получения фрагментов рекомбинантного белка VP35 вируса Марбург.
Взаимодействие МКА с фрагментами рек.VP35 ВМ в иммуноблоте.
Мембрана с очищенные полипептидами была обработана раствором очищенных МКА 3F9 в концентрации 1 мкг/мл. 1. pA4 (84–329 a.о. ); 2. pA3 (167–329 a.о); 3. pA1 (1–174a.о. ); 4. pA113 (1–278 a.о. ); 5, pA112 (167–278a.о. ); 6. pA2 (1–251a.о. ); 7. pA114 (84–278a.о. ).
Мембрана была обработана ПАТ мышиной сыворотки в разведении 1:3000 и раствором коньюгата антивидовых АТ с пероксидазой. 1. E. coli–pQE31 клеточный лизат; 2. pA112 (167–278a.о. ); 3. pA114 (84–278.a.о. ); 4 pA113 (1–278a.о. ); 5. pA4 (84 – 329a.о. ); 6, pA3 (167–329 a.о.); 7. pA1 (1–174a.о.).
.

Электрофореграмма моноклональных антител, очищенных
каприловой кислотой с последующим высаливанием
сульфатом аммония по методу (Bazin H. et al.,1990).
1 2 3 4 5 6 7
75
50
35
25
тяжелая цепь IgG
легкая цепь IgG
1 - белковые маркеры молекулярной массы (10 мкл), (Bio-Rad);
2,3,4 - препараты очищенных МКА 3F9, 7D8, 7H10, специфичные к вирусу Марбург (по 1 мкл);
5,6,7 – препараты очищенных МКА 1C1, 4A2, 1В2, специфичные к вирусу Эбола (по 1 мкл);
стрелками обозначены цепи иммуноглобулинов.

Метод ИФА “двойная антигенная ловушка” – “сэндвич”

Таблица 6. Данные по количеству пар МКА, исследованных в двухцентровом ИФА
формата “сэндвич” для выявления антигенов вирусов Марбург и Эбола

Титрование антигена вируса Марбург и рекомбинантного белка VP40
парой МКА 7D8 и 7H10* в двухцентровом ИФА “сэндвич”
Примечания: 7H10* - индикаторные МКА меченные биотином;
исходная концентрация препаратов антигенов 1 мг/мл,
первая точка титрования в разведении 1/400 соответствует концентрации 2500 нг/мл;
концентрация МКА для “захвата” антигенов – 10 мкг/мл;
концентрация индикаторных МКА, меченных биотином – 1 мкг/мл.
Определение концентрации белковых препаратов выполняли с использованием набора “Protein Assay Kit” (Bio-Rad, США) на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 495 нм.
В качестве отрицательного контроля в ИФА использовали пару МКА 4A2 и 1C1*, специфичные
к белку VP40 вируса Эбола.

Титрование антигена вируса Марбург и рекомбинантного белка VP35
парой МКА 3F9 и 3F9* в двухцентровом ИФА “сэндвич”
Примечания: 3F9* - индикаторные МКА меченные биотином;
исходная концентрация препаратов антигенов 1 мг/мл,
первая точка титрования в разведении 1/400 соответствует концентрации 2500 нг/мл;
концентрация МКА для “захвата” антигенов – 10 мкг/мл;
концентрация индикаторных МКА, меченных биотином – 1 мкг/мл.
Определение концентрации белковых препаратов выполняли с использованием набора “Protein Assay Kit” (Bio-Rad, США) на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 495 нм.
В качестве отрицательного контроля в ИФА использовали захватывающие антиген МКА 1С7,
специфичные к белку VP35 вируса Эбола.

Титрование антигена вируса Эбола
и рекомбинантного нуклеопротеина парой МКА 1B2 и 7B11*
в двухцентровом ИФА “сэндвич”
Примечания: 7B11* - индикаторные МКА меченные биотином;
исходная концентрация препаратов антигенов 1 мг/мл, первая точка титрования в разведении 1:400 соответствует концентрации 2500 нг/мл;
концентрация МКА для “захвата” антигенов – 10 мкг/мл;
концентрация индикаторныхМКА, меченных биотином – 1 мкг/мл.
Определение концентрации белковых препаратов выполняли с использованием набора “Protein Assay Kit” (Bio-Rad, США) на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 495 нм.
В качестве отрицательного контроля использовали пару МКА 9С7 и 5F11*, специфичных к
нуклеопротеину вируса Марбург.

Титрование антигена вируса Эбола и рекомбинантного белка VP40
парой МКА 4А2 и 1С1* в двухцентровом ИФА “сэндвич”
Примечания: 1C1* - индикаторные МКА меченные биотином;
исходная концентрация препаратов антигенов 1 мг/мл,
первая точка титрования в разведении 1/400 соответствует концентрации 2500 нг/мл;
концентрация МКА для “захвата” антигенов – 10 мкг/мл;
концентрация индикаторных МКА, меченных биотином – 1 мкг/мл.
Определение концентрации белковых препаратов выполняли с использованием набора “Protein Assay Kit” (Bio-Rad, США) на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 495 нм.
В качестве отрицательного контроля в ИФА использовали пару МКА 7D8 и 7Н10*,
специфичные к белку VP40 вируса Марбург.

Пара МКА, специфичных к белку VP40
вируса Эбола, “захватывает” вирусный антиген

1. Иммунохимическая реакция протекает в растворе.
2. Обратимое образование комплекса АГ+АТ 1:1
3. В качестве субстратов ферментов используют вещества, продукты превращения которых
являются окрашенными соединениями или, наоборот, окраска самих субстратов изменяется
в процессе реакции. Окрашенные соединения поглощают видимый свет , т. е.
электромагнитное излучение с длинами волн 400–700 нм. Поглощение света подчиняется
закону Бугера-Ламберта-Бера, в соответствии с которым оптическая плотность раствора в
определённом диапазоне прямо пропорциональна концентрации вещества. Для измерения
оптической плотности используется спектрофотометр.
ТМБ (тетраметилбензидин)
Пероксидаза хрена
Н2 О2