Исследование антиоксидантной активности фитопрепарата «Тигровый глаз - орто»

Действие активных форм кислорода (АФК) на клетки и ткани
Доза АФК
Low
High
Выживаемость
Гибель
Апоптоз
Некроз
Задержка роста
и старение
Митогенетическое и
пролиферативное
действие
Воздействие активных форм кислорода
в высоких концентрациях
на клетки и ткани приводит к их повреждению и гибели,
что является причиной многих заболеваний.
АФК в низких дозах
способствуют выживаемости

D A N G E R
Chemicals
Radiation
Microbial and virus infection
Free radicals
ROS
DNA damage
Carcinogenesis
Endogenic
Exogenic
?
Oxygen radicals
scavengers

Предпосылки работы. Природные соединения и их композиции являются потенциальными экзогенными «ловушками» АФК и других свободных радикалов и требуют научного анализа для их практического применения.
Задача работы состояла в исследовании антиоксидантной активности препарата
«Тигровый глаз – орто» на экспериментальных моделях in vitro: нефракционированной крови человека, изолированных гранулоцитах крови человека, ферментативной бесклеточной среде.

Объект и Метод
Работа проведена на клетках периферической нефракционированной крови, изолированных гранулоцитах человека
и на модели ферментативной реакции
Интенсивность генерации АФК была оценена
по люминол-зависимой хемилюминесценции с использованием хемилюминометра ХЕМИЛЮМ-12, который позволяет проводить измерения одновременно в 12 образцах.
Прибор разработан в Лаборатории клеточной нейробиологии Института биофизики клетки РАН.

ХЕМИЛЮМ-12
Хемилюминометр роторный 12-ячеечный
ХЕМИЛЮМ-12 работает с пробами объемом от 0,1 до 0,3 мл, помещаемыми одновременно в 12 ячеек. В процессе регистрации на экране монитора выстраиваются 12 графиков; через каждые 2,5 секунды на каждом из них ставится очередная точка.
Одновременная регистрация хемилюминесценции от 12 проб позволяет получить серию измерений с использованием минимального количества исследуемого материала.
Высокая чувствительность при стабильном уровне нуля, возможность регистрировать быстрые изменения хемилюминесценции, - все это при большом числе одновременно анализируемых проб малого объема - главные отличительные черты прибора.

Препарат «ТИГРОВЫЙ ГЛАЗ - орто»
дозозависимо понижал уровень продукции активных форм кислорода (АФК) в цельной крови человека. Высокий уровень АФК в крови является опасным и высокореактивным повреждающим фактором для клеток и тканей организма.
Проявление антиоксидантных свойств
препарата «ТИГРОВЫЙ ГЛАЗ – орто» в цельной крови человека

Нейтрофил -
полиморфноядерный нейтрофильный гранулоцит
Фагоцитоз
Дегрануляция
Респираторный взрыв
Фагоцитоз зимозана нейтрофилом
(с любезного разрешения
Dr. K.B.Pryzwansky)
5 мкм
1 – прикрепление частицы зимозана;
2 – образование псевдоподии вокруг зимозана;
3 - поглощение

Респираторный взрыв
2NADPH + 4O2 = 2NADP+ + 4O2- + 2H+
0,5-1 nmol/мин/106 клеток
Повышенная утилизация глюкозы
Усиленное потребление О2
Активация гексозомонофосфатного пути
Усиленная продукция активных форм кислорода
Активированная продукция АФК
Спонтанный уровень продукции АФК

Реактивные формы кислорода
HOCl
1O2
OH·
H2O2
O2-·
NO2·
SOD
O2-·
O2
O2
H2O2
H2O
H2O
Fe2+
Fe3+
NO
MPO
OONO-
HOONO
H2O
+ Cl-
nitrogen
dioxide
radical
peroxynitrite
anion
nitric
oxide
hydrogen
peroxide
hydroxyl
radical
singlet
oxygen
hypochlorus
acid
superoxide
anion radical

Антиоксидантные свойства препарата «ТИГРОВЫЙ ГЛАЗ – орто»
Препарат «ТИГРОВЫЙ ГЛАЗ – орто»
дозозависимо понижает высокий уровень спонтанной
продукции АФК изолированными нейтрофилами человека
Клетки были инкубированы с ТГ-орто в
возрастающих концентрациях
в течение 30 мин при 37оС

Влияние препарата «ТИГРОВЫЙ ГЛАЗ – орто» на опосредованную рецептором хемотаксического пептида продукцию АФК изолированными гранулоцитами крови человека
Препарат ТГ-орто
дозозависимо подавляет развитие
респираторного взрыва в изолированных
гранулоцитах.
Клетки были инкубированы с
ТГ-орто в различных разведениях
при 37оС в течение 30 мин,
затем активированы 1 мкМ N-формил-Met-Leu-Phe,
чтобы вызвать респираторный взрыв.

Клетки были инкубированы с
ТГ-орто в различных разведениях
при 37оС в течение 30 мин,
затем активированы 50 мкМ N-формил-Met-Leu-Phe, чтобы вызвать респираторный взрыв.
Влияние препарата «ТИГРОВЫЙ ГЛАЗ – орто»
на опосредованную рецептором хемотаксического пептида
продукцию АФК изолированными гранулоцитами крови человека
Препарат ТГ-орто
дозозависимо изменяет способность гранулоцитов продуцировать активные формы кислорода
.

PDK
Участники передачи сигнала от рецептора fMLF
Рецептор fMLF
Gi
Shc
Grb2
SOS
GAP
ras
raf
MAPK
каскад
PI3K
PKB/Akt
PI3P
PLC
Ca2+
DAG
PKC
PA
PLD
PA-AK
Кальмодулин
Ca2+-CK

Сигнальные пути, активируемые окислительным стрессом
HSF1
C-Jun
NF-kB
STAT
PLCγ1
PKC
PI3K
PKB
JAK
ERK
JNK
p38
Gene expression
changes
p53
Активные
Формы
Кислорода
(on J.L. Martindale & N.J. Holbrook, 2002, J.Cell.Physiol.)
DNA-PK

Оценка антиоксидантной активности
препарата «ТИГРОВЫЙ ГЛАЗ - орто» на модели
супероксид-анион продуцирующей ферментативной реакции
Препарат «ТИГРОВЫЙ ГЛАЗ - орто»
дозозависимо ингибирует
генерацию АФК в
ферментативной
бесклеточной реакции
«ксантин – ксантиноксидаза».
В реакции «ксантин – ксантиноксидаза»
продуцируется супероксид-анион радикал
Препарат

Выводы:
Антиоксидантная активность препарата «ТИГРОВЫЙ ГЛАЗ – орто» проявляется в цельной крови, на изолированных клетках и в ферментативной реакции.
Препарат «ТИГРОВЫЙ ГЛАЗ – орто» обладает высокой антиоксидантной активностью в дозах, достигаемых при его разведении более чем в 100000 раз.
Антиоксидантное действие исследуемого препарата направлено на супероксид-анион радикал, который является исходной формой активных интермедиатов кислорода.
Предполагается, что применение препарата может быть полезным при заболеваниях, сопровождающихся дисфункцией фагоцитов, связанной с избыточной нерегулируемой продукцией АФК.