МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ УКРАИНЫ Национальный технический университет Украины Факультет биотехнологии и биотехники;

Фенилкетонурия
Одним из наиболее распространенных наследственных заболеваний является фенилкетонурия
В Украине на 8300 новорожденных один ребенок рождается больной ФКУ

Фенилаланингидроксилаза катализирует реакцию преобразования
фенилаланин + О2 + тетрагидробиоптерин
↓
тирозин + вода + окисленный биоптерин

Цель работы
Провести ДНК-анализ мутаций и полиморфизма гена ФАГ и оптимизировать технологию проведения полимеразной цепной реакции для амплификации in vitro последовательности ДНК седьмого экзона этого гена.

Для достижения цели были поставлены основные задачи исследования:
ДНК-анализ мутаций
R408W, R158Q, Y414C, IVS10nt546, IVS12nt1 гена ФАГ
ДНК-анализ мутаций в последовательности 7-го экзона гена ФАГ
Анализ алельного полиморфизма VNTR-локуса 3`-нетранслированой области гена ФАГ

Объект и предмет исследования
Объект исследования - ДНК человека полученная из лейкоцитов периферической крови
Предмет исследования – анализ мутаций в 5, 7, 12 экзоне и 10, 12 интроне гена ФАГ

Методы:
Выделение и очистка ДНК;
амплификация in vitro последовательностей гена ФАГ методом полимеразной цепной реакции;
рестрикционный анализ ПЦР-продуктов;
гель-электрофорез

Этапы ДНК-анализа:
Выделение геномной ДНК из образцов венозной крови методом фенольной экстракции;
Амплификация in vitro фрагмента ДНК с помощью полимеразной цепной реакции;
Гидролиз ПЦР-продуктов при помощи эндонуклеаз рестрикции;
Гель-электрофорез в агарозном и полиакриламидном геле.

Схема рестрикционного анализа для детекции мутаций R408W эндонуклеазой рестрикции Eco1301
Сайт узнавания Eco1301 CC
-A-T-A-C-C-T-C-G-G-C-C-C
-T-A-T-G-G-A-G-C-C-G-G-G
: : : : : : : : : : : :
-A-T-A-C-C-T-T-G-G-C-C-C
-T-A-T-G-G-A-A-C-C-G-G-G
: : : : : : : : : : : :
Eco1301
-A-T-A-C C-T-T-G-G-C-C-C
-T-A-T-G-G-A-A-C C-G-G-G
: : : : : : : :
245 п. н.
148 п. н.
97 п. н.
AATT
GG
-A-T-A-C-C-T-C-G-G-C-C-C
-T-A-T-G-G-A-G-C-C-G-G-G
: : : : : : : : : : : :
Сайт узнавания Eco1301

Анализ мутации R408W.
1 2 3 4
1, 2 – R408W/норма, 3 – норма/норма,
4 – R408/R408W.

: : : :
19 п. н.
Фрагмент “нормальной” последовательности
Фрагмент последовательности с мутацией R158Q
-A-A-G-C
3`-T-T-C-T-G-C-C-T-T-C-5`
-T-T-C-T-G-T-C-T-T-C-
5`-A-A-G-C-3`
-T-T-C-G-G-C-C- T-T-C-
3`-T-T-C-T-G-C-C-T-T-C-5`
: : :
Схема рестрикционного анализа для детекции мутаций R158Q эндонуклеазой рестрикции MspI
5`-A-A-G-C-3`
3`-T-T-C-T-G-T-C-T-T-C-5`
: : :
: : : : : :
-C-G-G-A-A-G-

Анализ мутации R158Q.
123 п.н.
119 п.н.
1 2 3 4
1, 2 - R158Q/норма;
3, 4 - норма/норма.

На первом этапе мы рассматривали четыре паралельно протикающие реакции:
ДНК+Pr →ДНК.Pr Образование комплекса ДНК.Pr
ДНК.Pr →ДНК+Pr Разрушение комплекса ДНК.Pr
ДНК+Pr →ДНК*.Pr Образование комплекса ДНК*.Pr с неполной гомологией
ДНК*.Pr →ДНК+Pr Разрушение комплекса ДНК*.Pr с неполной гомологией

Концентрации реагентов описываются системой диф. уравнений:
Решив данную систему мы получили:

График зависимости концентрации ssДНК и комплексов ДНК.Pr, ДНК.Pr* от времени
x(t) – C(ssDNA)
y(t) – C(ssDNA.Pr)
z(t) – 10*C(ssDNA*.Pr)

На втором этапе мы рассматривали шесть паралельно протикающие реакции:
ДНК+Pr →ДНК.Pr Образование комплекса ДНК.Pr
ДНК.Pr →ДНК+Pr Разрушение комплекса ДНК.Pr
ДНК+Pr →ДНК*.Pr Образование комплекса ДНК*.Pr с неполной гомологией
ДНК*.Pr →ДНК+Pr Разрушение комплекса ДНК*.Pr с неполной гомологией
ssДНК.Pr + dNTP → ДНК + H3PO4 Образование двухцепочечной спирали ДНК
ssДНК*.Pr + dNTP → ДНК* + H3PO4 Образование двухцепочечной спирали ДНК

Данные процессы описываются системой диф. уравнений:

Оптимальный температурный режим отжига праймеров описывается формулой T=57.88+3.11e-0.0825τ

Зависимость концентрации ssDNA, DNA.Pr, DNA.Pr* и специфичности от времени, при температуре T=58С
Где: X – концентрация одноцепочечных молекул ДНК; Y - кон. комплексов ДНК.Пр;
Z - кон. не специфических скомплексов ДНК.Пр; A - кон. специфического ПЦР продукта;
B - кон. не специфического ПЦР продукта; S – отношение специфического ПЦР продукта к неспецифическому; S1 – отношение специфического ПЦР продукта к неспецифическому, рассчитаная при условии что специфические и не специфические комплексы превратятся в ПЦР продукт при элонгации.

Зависимость концентрации ssDNA, DNA.Pr, DNA.Pr* и специфичности от времени, при изменении температуры по формуле T=57.88+3.11e-0.0825τ
Где: X – концентрация одноцепочечных молекул ДНК; Y - кон. комплексов ДНК.Пр;
Z - кон. не специфических скомплексов ДНК.Пр; A - кон. специфического ПЦР продукта;
B - кон. не специфического ПЦР продукта; S – отношение специфического ПЦР продукта к неспецифическому; S1 – отношение специфического ПЦР продукта к неспецифическому, рассчитаная при условии что специфические и не специфические комплексы превратятся в ПЦР продукт при элонгации.

Схема рестрикционного анализа для детекции мутаций R252W (эндонуклеаза рестрикции AvaI).
-T-C-C-T-C-T-C-G-G-G-A-T-T-
-A-G-G-A-G-A-G-C-C-C-T-A-A-
: : : : : : : : : : : : :
AvaI
169 п. н.
113 п. н.
56 п. н.
Сайт узнавания AvaI C CG G
Фрагмент “нормальной” последовательности
Фрагмент последовательности с мутацией R252W
CT
GA
-T-C-C-T-C-T-T-G-G-G-A-T-T-
-A-G-G-A-G-A-G-C-C-C-T-A-A-
: : : : : : : : : : : : :
-T-C-C-T-C T-C-G-G-G-A-T-T-
-A-G-G-A-G-A-G-C-C C-T-A-A-
: : : : : : : : :
Сайт узнавания AvaI
-T-C-C-T-C-T-T-G-G-G-A-T-T-
-A-G-G-A-G-A-G-C-C-C-T-A-A-
: : : : : : : : : : : : :

Анализ мутаций R252W
1 - R252W/норма
2 - норма/норма
М - Маркер молекулярной массы

Электрофореграмма продуктов амплификации VNTR –полиморфизма
1 2 3 4 М
1 - генотип 3/3 (380/380 п.н.); 2 - генотип 3/7 (380/500 п.н.);
3 - генотип 3/8 (380/530 п.н.); 4 - генотип 9/12 (560/650 п.н.);
M - Маркер молекулярной массы ДНК плазмиды pBR322 гидролизированная эндонуклеазой MspI

Выводы
1. Проведен ДНК-анализ мутаций R408W, IVS12nt1, R158Q, Y414C, IVS10nt546 гена ФАГ в 68 образцах. Двадцать три из них в дальнейщем использовались в качестве ДНК-матрици для амплификации седьмого экзона гена ФАГ.
Подобраны условия для амплификации in vitro и рестрикции последовательности седьмого екзона гена ФАГ.
3. Рассчитана математическая модель отжига праймеров и предложен оптимальный температурный режим амплификации который представлен в виде функции T=57.88+3.11e-0.0825τ.
4. Проведен анализ аллельного полиморфизма VNTR-локуса гена ФАГ с использованием специфической амплификации in vitro последовательности 3'-нетранслированного участка этого гена.
5. Проведенные иследования позволили оптимизировать анализ идентифицируемых мутаций для проведения пренатальной ДНК-диагностики фенилкетонурии с целью предупреждения рождения больных детей.