Получение витаминов и коферментов биотехнологическими методами

Витамины - группа низкомолекулярных органических соединений относительно простого строения и разнообразной химической природы.
Витамины участвуют во множестве биохимических реакций, выполняя каталитическую функцию в составе активных центров большого количества разнообразных ферментов либо выступая информационными регуляторными посредниками, выполняя сигнальные функции экзогенных прогормонов и гормонов.
из 22

Каротиноиды - это изопреноидные соединения, синтезирующиеся многими пигментными микроорганизмами из рода Aleuria, Blakeslea, Corynebacterium, Flexibacter, Fusarium, Halobacterium, Phycomyces, Pseudomonas, Rhodotorula, Sarcina, Sporobolomyces и др. Всего описано около 500 каротиноидов.
из 22

Каротиноиды локализуются в виде сложных эфиров и гликозидов в клеточной мембране микроорганизмов, либо в свободном состоянии - в липидных гранулах в цитоплазме.
Каротиноид "ретиналь" у галофильного вида - Halobacterium halobium - соединен с белком через остаток лизина(опсинопо-добный белок); он участвует в синтезе АТФ благодаря генерации транс мембранного потенциала.
из 22

Основная функция каротиноидов - защитная. Их биосинтезу в клетках способствует свет.
В качестве продуцентов каротиноидов можно использовать бактерии, дрожжи, мицелиальные грибы. Более часто применяют зигомицеты Blakeslea trispora и Choanephora conjuncta. Спаривающиеся ( + ) и (-) штаммы этих видов при совместном культивировании могут образовать
3-4 г каротина на 1 л среды.
из 22

Вначале штаммы выращивают раздельно, а затем - совместно при 26?С и усиленной аэрации с последующим переносом в основной ферментатор. Длительность ферментации - 6-7 дней. Каротиноиды извлекают ацетоном (или другим полярным растворителем), переводят в неполярный растворитель.
В целях очистки и более тонкого разделения можно прибегать к методам хроматографии или к смене растворителей.
из 22

Витамин D - это группа родственных соединений, в основе которых находится эргостерин, который обнаружен в клеточных мембранах эукариот. Поэтому, например, пекарские или пивные дрожжи применяют для получения эргостерина, как провитамина, обладающего антирахитическим действием.
Содержание эргостерина в дрожжевых клетках колеблется в пределах 0,2-11%.
из 22

Трансформация эргостерина в витамин D2 (кальциферол) происходит под влиянием ультрафиолетового облучения. При этом разрывается связь в кольце (позиции 9,10) и образуется двойная связь в боковой цепочке
(позиции 22, 23).
Эта последняя гидрирована в витамине D3 (холекальциферол). Физиологическая активность обоих витаминов (D2 и D3) равноценна.
из 22

Получение эргостерина в производственных условиях можно подразделить на следующие этапы: размножения исходной культуры и накопление инокулята (инокулюма), ферментация, сепарирование клеток, облучение клеток ультрафиолетовыми лучами, высушивание и упаковка целевого продукта.
из 22

Культивирование дрожжей (ферментацию) проводят при температуре, близкой к максимальной для конкретного штамма, и выраженной аэрации (2% О2 в газовой фазе).
Спустя 3-4 суток клетки сепарируют и подвергают вакуум-высушиванию.
Затем сухие дрожжи облучают ультрафиолетовыми лучами - УФЛ в течение оптимального по продолжительности времени, при требуемой температуре и с учетом примесных веществ.
Получение облученных сухих дрожжей
из 22

Готовый препарат - "кормовые гидролизные дрожжи, обогащенные витамином D2".
В таком препарате содержится не менее 46% сырого белка, незаменимые аминокислоты (лизин, метионин, триптофан) и 5000 ME витамина D2 /г.
из 22

Клетки продуцента гидролизуют соляной кислотой при 110*С, затем температуру снижают до 75-78*С и добавляют этанол.
Смесь фильтруют при 10-15*С, оставшуюся после фильтрации массу промывают водой, высушивают, измельчают, нагревают до 78*С и дважды обрабатывают тройным объемом этанола.
Спиртовые экстракты объединяют и упаривают до 70%-го содержания сухих веществ.
Полученный "липидный концентрат" обрабатывают раствором едкого натра. Эргостерин кристаллизуется из неомыленнной фракции концентрата при 0*С. Его очищают повторной перекристаллизацией.
Кристаллы высушивают, растворяют в серном эфире, облучают УФЛ, эфир отгоняют, раствор витамина D2 концентрируют и кристаллизуют.
"Кислотный фильтрат" обычно упаривают до 50%-го содержания сухих веществ и применяют как концентрат витаминов.
Получение кристаллического витамина D2
из 22

Рибофлавин, или витамин В2 - содержится в клетках различных микроорганизмов, будучи коферментом в составе флавопро-теинов (прежде всего - соответствующих ферментов из класса оксидоредуктаз - ФМН, ФАД). Поэтому в качестве продуцентов рибофлавина (флавопротеинов) могут быть бактерии, дрожжи и нитчатые грибы. Однако наиболее заманчивыми являются те штаммы, которые образуют на жидких средах 0,5 г и более рибофлавина в 1 л среды. К подобным организмам относятся Ashbyii gossypii, Eremothecium ashbyii и Candida guilliermondii.
Методами генной инженерии удалось получить штамм сенной палочки, образующий около 6 г рибофлавина в
1 л среды, включающей мелассу, белково-витаминный концентрат и его гидролизат.
из 22

В качестве источников углерода применяют глюкозу или сахарозу, практикуют использование дрожжевого и кукурузного экстрактов, соевой муки, масла (жира).
Жидкие питательные среды для получения инокулята и для основной ферментации могут несколько различаться между собой.
Например, для получения посевного материала известна среда, содержащая сахарозу, пептон, кукурузный экстракт, калия дигидрофосфат, магния сульфат, подсолнечное масло, время выращивания продуцента на этой среде - 2 суток при 27-30*С (в зависимости от штамма).
Ферментационная среда обычно включает кукурузную и соевую муку, сахарозу, кукурузный экстракт, калия дигидрофосфат, кальция карбонат, натрия хлорид и ненасыщенный жир.
из 22

Обычно ферментацию проводят в течение 5 суток при рН 5,5- 7,7. После использования сахарозы (примерно через 30 часов) начинает заметно накапливаться витамин В2, вначале - в мицелии, а затем - в культуральной жидкости. Всю биомассу можно подвергнуть высушиванию и полученный сухой продукт с остаточной влажностью 8%, содержащий 1,5-2,5% рибофлавина, 20% белка, тиамин, никотиновую кислоту, пиридоксин, цианкобаламин, микроэлементы и другие вещества, рекомендуют для кормления животных.
из 22

Аскорбиновая кислота, или витамин С - это противоцинготный витамин, имеющийся у всех высших растений и животных.
Определенные виды уксуснокислых бактерий причастны к биосинтезу полупродукта этой кислоты - L-сорбозы. Весь процесс получения аскорбиновой кислоты является смешанным, то есть химико-ферментативным.
из 22

из 22

Ферментацию G.oxydans проводят на средах, содержащих сорбит (20%), кукурузный или дрожжевой экстракт, при интенсивной аэрации (8-10 г О2 л/ч). Выход L-сорбозы может достичь 98% за 1-2 суток. При достижении культурой log-фазы можно дополнительно внести в среду сорбит, доводя его концентрацию до 25%.
Ферментацию бактерий проводят в периодическом или непрерывном режиме. Принципиально доказана возможность получения L-сорбозы из сорбита с помощью иммобилизованных клеток в ПААГ.
из 22

Цианкобаламин, или витамин В12- получают только микробиологическим синтезом.
Его продуцентами являются прокариоты и, прежде всего, пропионовые бактерии, которые и в естественных условиях образуют этот витамин. Мутанты Propionibacterium shermanii M-82 и Pseudomonas denitrificans M-2436 продуцируют на жидкой среде до 58-59 мг/л цианкобаламина.
Его мировое производство достигло 10 т в год, из которых 6,5 т расходуют на медицинские нужды, а 3,5 т - в животноводстве.
из 22

Отечественное производство цианкобаламина базируется на использовании культуры P.freudenreichii var. shermanii, культивируемой в периодическом режиме без доступа кислорода.
Ферментационная среда обычно содержит глюкозу, кукурузный экстракт, соли аммония и кобальта, рН около 7,0 поддерживают добавлением NH4OH; продолжительность ферментации 6 суток; через 3 суток в среду добавляют 5,6-диметилбензимидазол - предшественник витамина В12 и продолжают ферментацию еще 3 суток.
Цианкобаламин накапливается в клетках бактерий, поэтому операции по выделению витамина заключаются в сепарировании клеток, экстрагировании водой и фильтрованиеи. Фильтрат упаривают и дополнительно очищают, после чего проводят кристаллизацию витамина.
из 22

Витамин В12 обладает высокой светочувствительностью, поэтому все операции необходимо проводить в затемненных условиях (или при красном свете).
На ацетонобутиловой и спиртовой бардах с добавлением солей кобальта и метанола в нашей стране получают кормовой препарат КМБ 12 - концентрат, содержащий витамин В12 и другие ростовые вещества.
из 22