Разработка новых препаратов для фотодинамической терапии ран, ожогов и трофических язв на основе наноразмерных комплексов амфифи

ПФС вводится внутривенно, либо применяется наружно в виде геля.
Затем прводят облучение пораженной области видимым светом.
ПФС переходит в возбужденное состояние, активирует молекулярный кислород …
…который пазрушает больные клетки.
Принципиальная схема фотодинамической терапии
Метод ФДТ, разработанный в 60-годы прошлого века для лечения злокачественных опухолей, основан на селективном воздействии лазерного излучения на предварительно обработанные фотосенсибилизатором (ФС) больные ткани.
В медицинской практике сейчас используются порфириновые фотосенсибилизаторы – наиболее активные и биологически совместимые с человеческим организмом тетрапиррольные соединения.
Для создания гелей и мазей, содержащих ПФС, используют нетоксичные полимеры, не участвующие в процессе ФДТ.

Ранее было показано, что в присутствии некоторых амфифильных полимеров эффективность ПФС при фотодинамическом воздействии на культуры опухолевых клеток, а также опухоли поверхностной локализации у лабораторных животных возрастает в 10 - 30 раз (патент РФ 2314806). Использовали культуры нормальных и опухолевых клеток шести разных типов и 1000 крыс линии Вистар.
Основная задача данной работы – создание препаратов на основе комплексов наноразмерных агрегатов порфиринов с амфифильными полимерами для фотодинамической терапии гнойных ран, осложненных ожогов, трофических язв.

Работа развивалась в трех направлениях – изучение механизмов влияния амфифильных полимеров на активность ПФС в модельных процессах фотоокисления, при фотодинамическом воздействии на клетки и исследование эффективности комплексов ПФС-АП при ФД-воздействии на раневые инфекции у лабораторных животных (крысы), а также при лечении хронических гнойных ран у больных.
Объекты и методы
В качестве фотосенсибилизаторов использовали димегин и фотодитазин - препарат, применяемый сейчас в клинической практике.
Использовали три группы амфифильных полимеров разной мол.массы и химической природы, в том числе плюроники.
1. Модельные условия – фотоокисление триптофана.
2. Испытания на животных: выполнены на 100 беспородных крысах-самцах с массой тела 250+10 г. Объектом ФД-воздействия служила огнестрельная мягкотканная инфицированная рана в области средней трети правого бедра животных.
3. Эффективность гелей на основе комплексов полимер- фотодитазин исследовали при лечении 45 больных.

Димегин
Фотодитазин
Динатриевая соль 2,7,12,18-тетраметил-3,8-ди (1-метоксиэтил)-13,17-ди (2-оксикарбонил этил) порфирина
N-метил-ди-D- глюкаминовая соль хлорина е6
I. Фотосенсибилизаторы:
2. Полимеры
этиленоксид
пропиленоксид
2. Поливиниловый спирт — СН2 —СН —
ОН
1. Плюроник

I. Влияние плюроников на кинетику фотосенсибилизированного окисления триптофана
Зависимость константы скорости фотоокисления триптофана (5×10-5 моль/л), в присутствии димегина (а) и фотодитазина (б) от концентрации плюроников Р85 (1), F127 (2). [ПФС] - 10-6 моль/л.
а
б
Таким образом, солюбилизация димегина повышает его активность в 1,5 раза, а фотодитазина в 6 раз. Соотношение концентраций плюроник/димегин при этом составляет 20:1; для фотодитазина –100:1. С увеличением концентрации плюроников их влияние на активность фотодитазина в модельных условиях резко уменьшается.

Влияние плюроников на агрегацию димегина и фотодитазина в воде по данным светорассеяния
Распределение по размерам мицелл плюроника F127 (7.9×10-5 моль/л) (а), (б); мицелл плюроника в присутствии 10-6 моль/л димегина (в); агрегатов димегина в водном растворе (10-6 моль/л), плюроника в присутствии фотодитазина (г). Фосфатный буфер, 37оС. [ФД, ДМ] - 10-6 моль/л. При увеличении концентрации плюроника до 10-3 моль/л средний размер мицелл не меняется. Размер агрегатов фотодитазина <1нм.
Размер мицелл плюроника, содержащих солюбилизированный фотодитазин в водном растворе составляет 10 -15 нм, размер мицелл плюроника с димегином ~100нм. Присутствие фотодитазина не меняет размеров мицелл плюроника.

Влияние фотодитазина на кристаллизацию плюроника (по данным АСМ)
Агрегаты полимер-порфирин в твердой фазе достигают размеров 100-500 нм, размеры ассоциатов фотодитазина ≤ 100 нм.
а
б
Рельеф участка поверхности (7х7мкм) плюроника F-127 (а) и его комплекса с фотодитазином (б), полученных при кристаллизации из воды на слюде.

ВОЗМОЖНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ВЛИЯНИЯ АМФИФИЛЬНЫХ ПОЛИМЕРОВ НА ФОТОИНДУЦИРОВАННУЮ ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ СЕНСИБИЛИЗАТОРОВ
Влияние на проницаемость плазматической мембраны (повышение содержания порфиринов в клетке);
Стабилизация дефектов (пор) в мембране, вызванных воздействием синглетного кислорода.
Влияние на клеточный метаболизм (торможение репаративных процессов);

ВЛИЯНИЕ ПОЛИМЕРОВ НА НАКОПЛЕНИЕ ФОТОДИТАЗИНА В КЛЕТКАХ
Полимеры не влияют на количество фотодитазина, проникшего в клетки
- в отсутствие полимеров
- в присутствии 0,1% Р85 (а) и ПВС (б)
(а)
(б)

ВЛИЯНИЕ МИЦЕЛЛ ПЛЮРОНИКА F127 НА РАЗМЕР ПОР МОДЕЛЬНОЙ ЛИПИДНОЙ МЕМБРАНЫ
Оказалось (по данным кинетики «вытекания «карбоксифлуресцеина), что плюроники не влияют на размер пор липидных мембран, возникающих под действием 1О2.
Схематичное изображение липидной мембраны со «встроенной» молекулой плюроника
Гидрофобный пропиленоксидный блок
Гидрофильные этиленоксидные фрагменты

Если влияние полимеров на фотоцитотоксичность ПФС обусловлено воздействием на клеточный метаболизм, то эффективность воздействия должна зависеть от длительности контакта полимеров и ПФС с клетками.

Инкубация
3 час
Освещение
лазером
Гибель
клеток
Добавление ФД или смеси ФД + полимер
Инкубация
2 суток
Оказалось, что эффект проявляется, если добавить полимер вместе с ФД за 3 часа до облучения. Если после инкубации отмыть полимер перед освещением, эффект исчезает или проявляется в малой степени. Добавление полимера после освещения не меняет процент гибели клеток.
апоптоз
некроз
Гибель
клеток
Схема эксперимента по изучению влияния времени экспонирования клеток с плюроником F127 и фотодитазином на величину обнаруженного эффекта.

В присутствии амфифильных полимеров клетки гибнут по механизму некроза
Механизмы гибели опухолевых клеток при ФДТ

2. Заживление огнестрельных ран у крыс при фотодинамической терапии с использованием комплексов фотодитазин-поливиниловый спирт

3. Комплексы полимер-фотодитазин в лечении гнойных ран у больных
3.1. Распределение больных по группам в зависимости от лечения фармакологических форм фотодитазина

3.2. Сроки очищения ран от гнойно-некротических масс,
появления грануляций и краевой эпителизации

Применение комплекса плюроник F127 - фотодитазин (0,1%ФД) при лечении гнойно-некротической раны лопаточной области
Исходное состояние после некроэктомии
На 2-сутки после воздействия комплекса и облучения (рана очистилась)
На 9 - сутки произошла эпителизация