Wet Lab

ДНК
(4 нуклеотида: А, Т, G, C)

Выделение ДНК

Выделение ДНК

Оценка качества и количества ДНК
Электрофорез
Спектрофотометрия
Флуорометрия
элетрофорез
спектрофотометрия
С[µg/ml] = А260 x K
K (dsDNA) = 50
K (ssDNA) = 37
K (ssRNA) = 40
А260 /А280 = 1,8-1,9 – чистая ДНК

Электрофорез

Плазмиды
Состав вектора:
Ориджин репликации
Селективный маркёр
Полилинкер

pBluescript II SK (+)

Севенирование ДНК
- прочтение последовательности
Классические методы:
Максам-Гилберт (химическое)
Сэнгер (энзиматическое)

Секвенирование (Сэнгер)

Автоматическое секвенирование

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
1983 г, Кэри Муллис
– метод, позволяющий избирательно синтезировать большие количества определённых фрагментов ДНК
«Полимеразная» - используется фермент ДНК-полимераза
«Цепная» - состоит из повторяющихся циклов, количество ДНК с каждым циклом увеличивается в геометрической прогрессии

Компоненты ПЦР
Буфер

Суть ПЦР

Этапы ПЦР

Амплификаторы
Термостатирование:
твёрдый термоблок (элемент Пельтье)
жидкость
поток воздуха

ПЦР в реальном времени
(Real-time PCR)
одновременная амплификация и измерение количества продукта
наличие флюоресцентного красителя в смеси
наличие оптического блока в амплификаторе

Системы детекции
Неспецифичные
интеркалирующие красители (SYBR Green и др.)
Специфичные
линейные разрушаемые пробы (TaqMan)
«молекулярные маячки» (beacons)
примыкающие пробы

Линейные разрушаемые пробы
(TaqMan = Taq-polymerase + Pac-Man)

Непрямые антикоагулянты:
варфарин
аценокумарол
фенпрокумон
кумарин
Фармакогенетика препаратов для лечения тромбозов

Заболевания, при которых назначают непрямые антикоагулянты:
Венозные тромбозы
Легочная тромбоэмболия
Тромбоэмболические осложнения, связанные с мерцательной аритмией и трансплантацией сердечных клапанов
Инфаркт миокарда: снижение риска смерти, повторного инфаркта миокарда и случаев тромбоэмболических осложнений

Нежелательные лекарственные реакции (НЛР) – кровотечения.
МНО (международное нормализованное отношение).
При применении варфарина частота кровотечений достигает 25%.
Факторы риска кровотечений при применении непрямых антикоагулянтов:
Сопутствующие заболевания
Применение других препаратов
Нарушение дозировки
Индивидуальная чувствительность
Непрямые антикоагулянты – антагонисты витамина К1

Метаболизм витамина К1
(factor II, VII, IX, X, protein C, S, Z)

Полиморфизм гена CYP2C9
Аллельные варианты гена:
CYP2C9*1 – нормальная каталитическая активность
CYP2C9*2 (Arg144Cys) - пониженная
каталитическая активность
CYP2C9*3 (Ile359Leu) – выраженная пониженная
каталитическая активность
ATT
1075
Ile
Exon 3 Exon 7
TGT
ATT
430
1075
Cys
Ile
Exon 3 Exon 7
CGT
CTT
430
1075
Arg
Leu