Законодательная база

Соответствие требованиям
Перед реализацией стерильного продукта необходимо провести его тест на бактериальные эндотоксины
Процедура проведения теста и допустимые пределы эндотоксинов определены в Новой гармонизированной статье и руководстве FDA
Как и для других тестов испытаний качества, валидация теста бактериальных эндотоксинов является ключевым моментом перед релизом продукции на рынок

Валидация
Ключ к успеху ЛАЛ-теста

Валидация
Зачем валидировать?
Подтвердить функционирование
Подтвердить воспроизводимость
Это необходимо для теста бактериальных эндотоксинов, как и для любого параметра качества

Валидация
Какими ресурсами можно пользоваться при валидации
Руководство FDA
Новая гармонизированная статья
Документация производителя ЛАЛ

Руководство FDA
“…руководство… процедуры или стандарты…признаваемые FDA…Руководство не является законом, однако следуя данному руководству, можно быть уверенным, что данные процедуры или стандарты приемлемы FDA.”

Руководство...
Руководство FDA:
Определяет пределы эндотоксинов для фармацевтических препаратов и изделий медицинского назначения.
Описывает процедуру валидации ЛАЛ-теста для готового продукта.
Описывает процедуру разработки стандартного протокола испытаний.
Одно из основных отличий Руководства FDA Новой гармонизированной статьи – это детализация описаний стандартного протокола испытаний

Требования к валидации теста бактериальных эндотоксинов
Независимо от продукта
Лаборатория / аналитик
Подтверждение чувствительности лизата или линейности
Оборудование, программное и аппаратное обеспечение
Дополнительные требования, например требования к условиям хранения образцов
Касательно продукта
Тест ингибирования / усиления
(3) партии продукта

Валидация независимо от продукта
Соответствие лаборатории / аналитика
Подтверждение чувствительности лизата или линейности в исполнении нового аналитика
Подтверждение функционирования реактива
Подтверждение чувствительности лизата или линейности при изменении партии
Два этих требования можно проверить в одном анализе

Признанные методы
Руководство FDA по валидации ЛАЛ-теста
Признанные ЛАЛ-методы:
Гель-тромб тест
Хромогенный конечной точки
Турбидиметрический конечной точки
Кинетический турбидиметрический
Кинетический хромогенный*
* Interim Guidance ; July , 1991

Подтверждение заявленной чувствительности
Подтверждение заявленной чувствительности производится по стандартной процедуре в 4 репликатах
Подсчитывается среднее геометрическое
Результат должен быть в диапазоне двойных разведений заявленной чувствительности

Подтверждение заявленной чувствительности
Среднее геометрическое вычисляется путем суммирования log крайней концентрации эндотоксина при которой образуется гель для каждого репликата
4 значения log суммируются и делятся на 4
Antilog результата и есть среднее геометрическое значение

Пример подтверждения чувствительности

Вычисление среднего геометрического значения
Результаты примера:
Log 0.125 + Log 0.125 + Log 0.063 + Log 0.063
Просуммировать результаты и разделить на 4
antilog результата = 0.09 ЕЭ/мл
Допустимый диапазон 0.25 до 0.063 ЕЭ/мл
Результат анализа – аналитик / реактив соответствует требованиям

Количественные анализы – подтверждение линейности
Оператор должен создать стандартную кривую по 4 репликатам
Для анализа применяется полный диапазон, например 50-0.005 ЕЭ/мл
Корреляционный коэффициент должен быть >0.98 (-0.98)
Результаты не усредняются

Подтверждение линейности хромогенного теста конечной точки

Подтверждение линейности кинетического теста

Валидация
независимо от продукта
Оборудование
Валидация нагревательного блока или водяной бани
Валидация оптической линейности и равномерности распределения температуры для кинетических ридеров
Валидация программного обеспечения для кинетических систем
Данные процедуры должны проводиться как IQ/OQ/PQ перед применением
Валидационную документацию получают от производителей, в особенности на программное обеспечение

Валидация
независимо от продукта
Дополнительные требования
Валидация контейнеров для хранения
Храните предполагаемый определяемый уровень концентрации эндотоксина в течение максимального ожидаемого срока хранения
Депирогенизационные шкафы
Оборудование для депирогенизации стеклянной посуды должны валидироваться как минимум ежегодно
Аксессуары
В Гармонизированной статье указано, что наконечники, планшеты, др. также требуется валидировать

Валидация с продуктом
Данная процедура необходима для доказательства того, что продукт не оказывает интерферентное действие на ЛАЛ-реактив
Наиболее широко применяемый метод преодоления интерферентных действий является разведение ЛАЛ-реагентной водой
Необходимо определить правильное разведение/обработку продукта

Предельное значение эндотоксина
Первым требованием является определение предельного значения эндотоксина в тестируемом продукте
Это может быть указано в монографии фармакопеи
Если не существует монографии, требуется произвести вычисления
Метод расчета включает константы, которые применяются для определения максимальной дозы для человека

Предельное значение эндотоксина
Определение предельного значения эндотоксина
Исходно установлена доза / предел чувствительности теста на кроликах
Пределы для ЛАЛ-теста были установлены HIMA в 1980
Определенная тогда доза эндотоксина, вызывающая пирогенную реакцию в теле человека применима и сейчас - 5 ЕЭ/кг

Предельные значения эндотоксина
По данным HIMA пирогенность E. coli 055:B5 эндотоксина (EC-2).

Предельные значения эндотоксина
Пирогенность E. coli 055:B5 эндотоксина по данным HIMA
Вывод:
Данные исследования установили с 95% точностью, что статистически средняя лаборатория будет получать 50% положительных/отрицательных результатов теста при концентрации выше 0.098 нг/мл эндотоксина Difco E. coli 055:B5
Dabba et al. J. PDA 34:212,1980

Единицы эндотоксина
Определение единиц эндотоксина:
Одна единица эндотоксина = минимальная концентрация стандартного эндотоксина U.S. standard endotoxin EC-2, дающего положительный результат со стандартным лизатом U.S. Reference Lysate Lot 4.

Предельные значения эндотоксина
Активность EC-2 при 5 ЕЭ/нг дает увеличение ограничения дозы 5 ЕЭ/кг, применяемая и сейчас
Доза 2.5 ЕЭ/кг принято в 1990 USP для радиофармацевтических препаратов
Значительно более низкая доза 0.2 ЕЭ/кг принята для интратекальных препаратов в 1983

Предельные значения эндотоксина
Вычисление предельного значения эндотоксина для фармацевтических препаратов
Предельные значения эндотоксина = (K / M) x активность
K= макс. Допустимое к-во эндотоксина
5.0 ЕЭ/кг/час или 350 ЕЭ/на тело человека/час
0.2 ЕЭ/кг/час или 14 ЕЭ/на тело человека/час (интратекальные)
M= Макс. Человеческая доза
Активность = концентрация препарата
(не требуется, если доза выражена в мл)

Вычисление предельного значения эндотоксина
Пример 1
Инсулин
Доза: 2 ед/кг
Активность: 100 ед/мл
Вычисление предельного значения эндотоксина:
Example 2
5% глюкоза
Доза: 10 мл/кг
Активность: неприменимо
Вычисление предельного значения эндотоксина :

Нестандартные предельные значения эндотоксина
противоопухолевые
Предел эндотоксина =
K= макс. Допустимая доза эндотоксина 5ЕЭ/кг/час
M= макс. Чел. доза (на м2)
Радиофармацевтические
Предел эндотоксина = 175ЕЭ/V
V= макс. доза isotope expiration

Вычисление степени разведения
При разведении образца для преодоления влияния интерферентных факторов эндотоксин, содержащийся в образце, соответственно тоже разводится
В итоге концентрация эндотоксина снижается до уровня, не определяемого методом. Вследствие это необходимо рассчитать:
максимальное допустимое разведение
или
Минимальную допустимую концентрацию

Максимальное допустимое разведение
Рассчитывается максимальное допустимое разведение
Применяется термин лямбда λ:
Заявленная чувствительность лизата для гель-тромб теста
Нижний стандарт для количественных анализов
максимальное допустимое разведение =

Пример расчета максимального допустимого разведения (МДР)
Гель-тромб
Чувствительность лизата 0.06
Предел эндотоксина для продукта 3.0 ЕЭ/мл
МДР = 1:50
Кинетический хромогенный
Нижний стандарт 0.005
Предел эндотоксина для продукта 3.0 ЕЭ/мл
МДР = 1:600

Пример расчета максимального допустимого разведения (МДР)
Дифенин натрия
Максимальная доза: 15 мг/кг
Чувствительность лизата: 0.005 ЕЭ/мл
Концентрация (активность) препарата: 50 мг/мл
МДР = 3,333.33 или 3,300 для удобства

Минимальная допустимая концентрация (МДК)
Степень разведения продукта можно выразить в МДК
Данная величина как правило применяется когда предел эндотоксинов выражен в ЕЭ/мг
МДК = Предел эндотоксина/мг деленный на лямбду λ (как и в случае с МДР)

Минимальная допустимая концентрация
МДК определяется следующим образом:
Где:
λ = чувствительность лизата или нижний стандарт
M = максимальная человеческая доза
K = 5.0 ЕЭ/кг
МДК = λ M / K

Примеры МДК
Циклофосфамид
Макс. доза: 25.0 мг/кг
Лизат: гель-тромб с чувствительностью 0.125 ЕЭ/мл
Расчет:
МДК = 25.0 мг/кг x 0.125 ЕЭ/мл
5.0 ЕЭ/кг
МДК = 0.625 мг/мл

Проверка интерференции
Следующим шагом валидации является тестирование интерференции продукта при тесте
Интерференция может вызвать завышение (усиление) или занижение (ингибирование) результатов
Валидационные тесты часто называют тестами ингибирования / усиления
Примеры:

Тест ингибирования / усиления
(Гель-тромб метод)

Тест ингибирования / усиления
(хромогенный метод конечной точки)

Тест ингибирования / усиления
количественный метод
Время
Концентрация эндотоксина
Продукт
Продукт + нагрузка
1. Продукт
2. Продукт + нагрузка
Разница должна быть 50-200% нагрузки

Стандартная кривая продукта
Как правило применяется для наиболее сложных продуктов!

После валидации…
Рутинное тестирование

Требования к рутинному тестированию
Гель-тромб метод
3 образца из партии
в 2 экземплярах
В диапазоне МДР
Положительный контроль продукта
Отрицательный контроль

Требования к рутинному тестированию
Количественные методы конечной точки
3 образца из партии
в 2 экземплярах
В диапазоне МДР
Положительный контроль продукта: 4λ
Отрицательный контроль
Стандарт с каждым тестом
Линейность: R > |0.980|

Требования к рутинному тестированию
Количественные кинетические методы
3 образца из партии
в 2 экземплярах
В диапазоне МДР
Положительный контроль продукта: PFC (пределы прохождения и непрохождения)
Отрицательный контроль
Стандарт с каждым тестом
Линейность: R > |0.980|

Граница прохождения/непрохождения
Предельное значение эндотоксина
разведение
PFC =
Если: PFC меньше либо равен 1.0 тогда нагрузка 0.5 ЕЭ/мл
Если: PFC больше 1.0 тогда нагрузка 5.0 ЕЭ/мл

Пример PFC
Предельное значение эндотоксина
= 0.5 ЕЭ/мл
Разведение = 1/10
PFC = 0.5 = 0.05 нагрузка 0.5 ЕЭ/мл
10
Предельное значение эндотоксина = 75 ЕЭ/мл
Разведение = 1/25
PFC = 75 = 3.0 нагрузка 5.0 ЕЭ/мл
25

Изделия медицинского назначения
Особый случай

Изделия медицинского назначения
В случае с изделиями медицинского назначения эндотоксин необходимо извлечь или смыть
Следовательно процедура тестирования изделий медицинского назначения включает шаг элюирования
Элюентом как правило является ЛАЛ-реагентной воды, в которой выдерживается продукт в течение часа при 37oC

Изделия медицинского назначения
Пределы для изделий медицинского назначения недавно изменились
Экстракция или элюирование являлись основой для определения эндотоксинов при объеме элюирования 40 мл на изделие
Прежний предел был основан на 0.5 ЕЭ/мл в суммарном экстракте

Изделия медицинского назначения
Прежний предел определял диапазон 3-10 единиц но при этом не разрешалось разведение экстракта
В случае если изделие было слишком велико для смыва 40 мл, данный объем вызывал вопросы
Предел эндотоксинов достаточно низкий по сравнению с парентеральными препаратами, однако суммирование экстрактов в какой-то мере это компенсирует

Изделия медицинского назначения
Изделия медицинского назначения
USP 23, приложение 1
Выборка мин. 3 и макс. 10 изделий
Определите объем для смыва в зависимости от размера и конфигурации изделия:
K=допустимое количество эндотоксина на изделие
N=количество тестируемых изделий
V= общий объем экстракционного раствора

Изделия медицинского назначения
Изделия медицинского назначения
USP 23, приложение 1
пределы:
20.0 ЕЭ/изделие
2.15 ЕЭ/изделие для изделий цереброспинального контакта
В новой монографии описан расчет МДР для элюата

Руководство EP
В руководствах FDA и EP существовал ряд отличий
Исходные руководства были сходны, однако имелись различия и разночтения, что вызывало вопросы
Новый гармонизированный текст устраняет различия

Контролирующие органы
Краткая характеристика

FDA
Департамент службы здравоохранения Department of Public Health Service и одна из старейших организаций защиты прав потребителей США
В 1977 опубликовано тестирование эндотоксинов (№ 42 FR 57749), заменяющий тест на кроликах.
Опубликованные документы о ЛАЛ-тесте:
Руководство по валидации ЛАЛ-теста как теста на эндотоксины в парентеральных препаратах для человека и животных, биопродуктах и изделиях медицинского назначения -Guidelines validation of LAL test as an end-product endotoxin test for human and animal parenteral drugs, Biological products, and medical devices. Dec 1987.
Временное руководство по препаратам для человека и животных и биопродуктам - Interim Guidance for human and veterinary drug products and Biologicals. July 1991.

Фармакопея США
Основана в 1820
Поправки публикуются на Фармакопейном форуме
ЛАЛ-тест описан как биологический тест в разделе <85> USP 23 NF как тест бактериологических эндотоксинов, введен в действие в 1995.

Европейская Фармакопея
Основана в 1964
Интегрирована в Европейский департамент качества медицинских препаратов European Department for the Quality of Medicines(EDQM) , май 1994.
EP содержит описание более 250 общих аналитических методов, на которых основаны спецификации монографий. Данные тесты могут быть биологическими, физическими, др.

Гармонизация документов
Новый гармонизированный текст

Международная гармонизация
Are we singing a pleasant tune?

гармонизировать
По Вебстеру «гармонизировать»:
“согласовывать, слаживать”
в 2000 опубликован и вступил в силу новый текст в Приложении 2 к USP24-NF 19

Гармонизированный документ
Появился в результате сотрудничества США, Европы и Японии
На основе 4 документов:
Тест на бактериальные эндотоксины USP, EP и JP
Руководство FDA
А также Руководство EP

Фармакопейные статьи
Что описано в фармстатьях ?
Что не описано ?
Облегчит ли это ЛАЛ-тест?

Пределы и стандарты
Калькуляция предела эндотоксина такая как в EP по λ и без λ ‘m’ (уст. термин)
Расчет максимального допустимого разведения остался таким же, однако определение λ находится в описании раствора C в таблице 4
Стандарты эндотоксина гармонизированы

Одобренные методы
Гель-тромб:
Гель-тромб тест предела
Гель-тромб анализ
Фотометрические методы:
Турбидиметрический конечной точки
Хромогенный конечной точки
Кинетический турбидиметрический
Кинетический хромогенный

Арбитраж
В случае споров по-прежнему применяется гель-тромб, если иное не указано в монографии
Данный текст является основой ЛАЛ методик для различных препаратов, с оговоркой что гель-тромб метод подходит не для всех препаратов

Гель-тромб метод
Испытание на соответствие Confirmation Test требует один флакон лизата
Четыре стандарта на 2λ, λ, 0.5λ и 0.25λ и отрицательный контроль анализируются в четырех репликатах
Чувствительность лизата считается подтвержденной если среднее геометрическое не менее 0.5λ и не более 2λ

Гель-тромб метод
Тест на интерферентные факторы требует 2λ, λ, 0.5λ и 0.25λ стандарты приготовленные в ЛАЛ-реагентной воде и в образце (не превышая МДР)
стандарты в ЛАЛ-реагентной воде анализируются в двух репликатах и в образце анализируются в четырех репликатах
стандарты в ЛАЛ-реагентной воде должны подтвердить λ
Чувствительность лизата в образце должна быть не менее 0.5λ и не более 2λ

Гель-тромб тест предела
Самый простой ЛАЛ-тест – требуется только 8 пробирок

Гель-тромб метод
Существуют трудности метода. Только в образец
самой высокой концентрации добавляется эндотоксин

Фотометрические методы
Четыре фотометрических метода сгруппированы под одним заголовком
Предварительным требованием является верификация стандартной кривой и тестирование интерферентных факторов
Для верификации стандартной кривой анализируются минимум 3 концентрации. Коэффициент корреляции должен быть >= 0.980 (-0.980)

Фотометрические методы
Для того чтобы тест считался не имеющим интерферентности
Восстановление должно быть 50% до 200% известной
Концентрации эндотоксина

Гармонизированный текст
Термин контрольный стандарт эндотоксина CSE более не применяется, применяется термин «стандарт»
FDA признает сертификат анализа производителя лизата, что ожидается и в будущем
Нет определенных требований по применению лицензированного лизата

Гармонизированный текст
Отсутствует детализация методов расчета для фотометрических методик
Единственное требование к коэффициенту корреляции >= 0.980 (-0.980)
В USP и EP отсутствует запрещение применения техник улучшения стандартной кривой, например Powercurve™

Соотношение с руководством FDA
Важно помнить что документы USP и EP относятся к одному тесту
Данные документы не включают:
Промышленные испытания для релиза продукта на рынок
Отбор проб
Повторные испытания
в EP изделия медицинского назначения

Руководства
Скорее всего руководство FDA будет еще применяться какое-то время
FDA планирует выпустить поправки (планируется с 1993 !)
Противоречивые предварительные руководства EP отменены