Блоттинг

Иммунологические методы анализа

Вестерн блот - аналитический метод, используемый для определения в образце специфичных белков, основанный на технике «блоттинга»
Блоттинг - перенос НК, белков и липидов на твердую подложку, например, мембрану и их иммобилизация
Что такое блоттинг?

Применение
Оценка изменений концентрации целевого белка
Распознавание модификаций целевого белка
Выявление взаимодействия целевого белка с другими белками

Этап №1
Пробоподготовка

Выделение белков
Из органов и тканей
Из клеточной культуры
Из физиологических жидкостей
Из культуральной жидкости
Готовые белковые растворы
Оценка качества препаратов

Выделение белков из клеток
Химические методы
Химический лизис (детергенты)
Физические методы
Соникация
Гомогенизирование

Центрифугирование

Общая схема анализа

Этап №2
Электрофорез

Электрофорез
Разделение белков в клеточном лизате по размеру
Полиакриламидный гель – разделяющий гель, по которому белки способны двигаться под действием электрического тока с различной скоростью (в зависимости от их величины, заряда и некоторых других факторов);
SDS (натрия додецилсульфат) – детергент, обеспечивающий денатурацию белков и придающий всем полипептидам отрицательный заряд

Чем меньше белок, тем быстрее они проходит через полиакриламидный гель

Гель-электрофорез

Этап №3
Перенос

Перенос
Под действием электрического тока белки мигрируют из геля на мембрану
Мембраны с высокой способностью связывания белков (обычно это нитроцеллюлоза или PVDF)

перенос

Этап №4
Блокирование

Блокирование
Процесс, используемый для исключения неспецифического связывания мембраной антител, используемых для детекции белка
Обычно с этой целью мембрану помещают в разбавленный раствор БСА (бычий сывороточный альбумин)

Общая схема анализа

Этап №5
Обработка антителами

Антитела
Моноклональные – к одному конкретному антигену патогена
Поликлональные – ко всем антигенам патогена

Инкубация с первичными антителами
Инкубация мембраны с раствором первичных антител к искомому белку
Промывка

Инкубация со вторичными антителами
Инкубация мембраны с раствором вторичных антител
Промывка

Зачем использовать вторичные антитела?
Усиление сигнала

Детекция
Хемилюминисцентная детекция
Флуоресцентная детекция
Колориметрическая детекция

Контроль загрузки
Ponceau S
Housekeeping gene proteins
Белки генов «домашнего хозяйства»

https://www.youtube.com/watch?v=CEEekahiqMo