Блоттинг

Содержание

Слайд 2

Иммунологические методы анализа

Иммунологические методы анализа

Слайд 3

Вестерн блот - аналитический метод, используемый для определения в образце специфичных белков, основанный

Вестерн блот - аналитический метод, используемый для определения в образце специфичных белков,
на технике «блоттинга»

Блоттинг - перенос НК, белков и липидов на твердую подложку, например, мембрану и их иммобилизация

Что такое блоттинг?

Слайд 5

Применение

Оценка изменений концентрации целевого белка
Распознавание модификаций целевого белка
Выявление взаимодействия целевого белка с

Применение Оценка изменений концентрации целевого белка Распознавание модификаций целевого белка Выявление взаимодействия
другими белками

Слайд 6

Этап №1 Пробоподготовка

Этап №1 Пробоподготовка

Слайд 7

Выделение белков

Из органов и тканей
Из клеточной культуры
Из физиологических жидкостей
Из культуральной жидкости
Готовые белковые

Выделение белков Из органов и тканей Из клеточной культуры Из физиологических жидкостей
растворы
Оценка качества препаратов

Слайд 8

Выделение белков из клеток

Химические методы
Химический лизис (детергенты)
Физические методы
Соникация
Гомогенизирование

Выделение белков из клеток Химические методы Химический лизис (детергенты) Физические методы Соникация Гомогенизирование

Слайд 9

Центрифугирование

Центрифугирование

Слайд 11

Общая схема анализа

Общая схема анализа

Слайд 12

Этап №2 Электрофорез

Этап №2 Электрофорез

Слайд 13

Электрофорез

Разделение белков в клеточном лизате по размеру
Полиакриламидный гель – разделяющий гель, по

Электрофорез Разделение белков в клеточном лизате по размеру Полиакриламидный гель – разделяющий
которому белки способны двигаться под действием электрического тока с различной скоростью (в зависимости от их величины, заряда и некоторых других факторов);
SDS (натрия додецилсульфат) – детергент, обеспечивающий денатурацию белков и придающий всем полипептидам отрицательный заряд

Слайд 14

Чем меньше белок, тем быстрее они проходит через полиакриламидный гель

Чем меньше белок, тем быстрее они проходит через полиакриламидный гель

Слайд 15

Гель-электрофорез

Гель-электрофорез

Слайд 17

Этап №3 Перенос

Этап №3 Перенос

Слайд 18

Перенос

Под действием электрического тока белки мигрируют из геля на мембрану
Мембраны с высокой

Перенос Под действием электрического тока белки мигрируют из геля на мембрану Мембраны
способностью связывания белков (обычно это нитроцеллюлоза или PVDF)

Слайд 19

перенос

перенос

Слайд 22

Этап №4 Блокирование

Этап №4 Блокирование

Слайд 23

Блокирование

Процесс, используемый для исключения неспецифического связывания мембраной антител, используемых для детекции белка
Обычно

Блокирование Процесс, используемый для исключения неспецифического связывания мембраной антител, используемых для детекции
с этой целью мембрану помещают в разбавленный раствор БСА (бычий сывороточный альбумин)

Слайд 24

Общая схема анализа

Общая схема анализа

Слайд 25

Этап №5 Обработка антителами

Этап №5 Обработка антителами

Слайд 26

Антитела

Моноклональные – к одному конкретному антигену патогена
Поликлональные – ко

Антитела Моноклональные – к одному конкретному антигену патогена Поликлональные – ко всем антигенам патогена
всем антигенам патогена

Слайд 27

Инкубация с первичными антителами

Инкубация мембраны с раствором первичных антител к искомому белку
Промывка

Инкубация с первичными антителами Инкубация мембраны с раствором первичных антител к искомому белку Промывка

Слайд 28

Инкубация со вторичными антителами

Инкубация мембраны с раствором вторичных антител
Промывка

Инкубация со вторичными антителами Инкубация мембраны с раствором вторичных антител Промывка

Слайд 29

Зачем использовать вторичные антитела?

Усиление сигнала

Зачем использовать вторичные антитела? Усиление сигнала

Слайд 30

Детекция

Хемилюминисцентная детекция
Флуоресцентная детекция
Колориметрическая детекция

Детекция Хемилюминисцентная детекция Флуоресцентная детекция Колориметрическая детекция

Слайд 31

Контроль загрузки

Ponceau S

Housekeeping gene proteins
Белки генов «домашнего хозяйства»

Контроль загрузки Ponceau S Housekeeping gene proteins Белки генов «домашнего хозяйства»

Слайд 32

https://www.youtube.com/watch?v=CEEekahiqMo

https://www.youtube.com/watch?v=CEEekahiqMo
Имя файла: Блоттинг.pptx
Количество просмотров: 54
Количество скачиваний: 0