ДНК секвенирлеу әдістері

Биополимерлердің бірінші реттілігін анықтайтын әдісте секвенирлеу деген арнайы термин қолданылады.
Белгілі ДНК молекуласындағы нуклеотидтердің санын мен ретін жалғыз-жалғыздан ретті түрде ыдырауы арқылы анықтауға болады.

Сэнгер әдісі: «терминатор» әдісі.
4 кезең:
Денатурация
Синтез
Терминация
Электрофорез

Сэнгер әдісі: «терминатор» әдісі.

O
H
H
O = P – O
O
O
2’, 3’ dideoxy nucleotide Can not form phosphodiester bound with next coming dNTP
Base

Сэнгер әдісі
Белгіленген праймер мен бастапқы матрицаны қосу.
ddNTP-ді 4 пробирканың біріне қосуы.

A
C
G
T
Сэнгер әдісі

Automated Version of the Dideoxy Method

Overview of Sanger sequencing method

ДНК + полимераза +
праймер +
dCTP dTTP dGTP dATP
ddATP ddGTP ddTTP ddCTP
полимеразная реакция с одним праймером
электрофорез
A•T G•C A•T T•A C•G T•A G•C G•C A•T G•C T•A T•A C•G T•A G•C A•T
Автоматизация секвенирования по Сэнгеру
До 96 независимых реакций, длина чтения до 900 н.
Время одного прогона ~ 40 минут
синтез

Метод Максама-Гилберта
В основе метода секвенирования ДНК путем химической деградации лежит ограниченное расщепление меченого фрагмента ДНК под действием специфических реагентов. Непременным условием проведения секвенирования этим методом является наличие фрагмента ДНК, меченного только по
одному концу. Определение нуклеотидной последовательности – методом ЭФ в ПААГ в последующей авторадиографией.

Стадии
Двухцепочечный фрагмент, подлежащий секвенированию, изолирован и радиоактивно помечен на 5’-концах 32P.
2. Затем фрагмент разрезают ферментом рестрикции и таким образом метку удаляют с одного конца.
3. Фрагмент ДНК с одним меченым концом денатурируется.
4. Четыре идентичных образца этих концевых меченых фрагментов рестрикции ДНК подвергаются химическому расщеплению на различных химических нуклеотидах.
5. Существует четыре специфических набора химических реакций, которые избирательно разрезают костяк ДНК в G, A+G, C+T или C остатках.
G only: Dimethyl sulphate(DMS)
and piperidine
A+G : DMS, piperidine
C+T : Hydrazine, piperidine
C only : Hydrazine,
piperidine
Figure: Maxam-Gilbert method
(continued)
Lodish, H.;Berk, A. et. al. (4th ed);
Mol. Cell Biol.; W. H. Freeman and Co. (2000)
p: 233

9. The labeled fragments
in the gel are visualized
by autoradiography.
10. The sequence is read
from bottom to top of
the gel.
Figure: Maxam-Gilbert method
Lodish, H.;Berk, A. et. al. (4th ed);
Mol. Cell Biol.; W. H. Freeman and Co. (2000)
p: 233

Химическая модификация азотистых основание заключается в:
Депуринизации (A+G) с использованием муравьиной кислоты
Метилировании гуанина с использованием диметилсульфата
Гидролизе пиримидинов (C+T) с использованием гидразина. При этом, добавление NaCl в реакцию с гидразином ингибирует гидролиз цитидина.
Модифицированные основания удаляются либо при повышении температуры, либо под действием кислоты или др. хим агентов (напр., пиперидин).
Образуются олигонуклеотиды, длины которых определяется методом ЭФ.

(Next generation sequencing),
NGS

Общая схема работы NGS: от исходной ДНК до «букв» на экране
приготовление библиотеки (дробление ДНК и лигирование адаптеров)
амплификация индивидуальных фрагментов и отжиг праймеров
синтез цепи, комплементарной секвенируемому фрагменту
регистрация сигнала
интеграция сигнала, перевод в последовательность ДНК (basecalling)

454 – принцип метода
ДНК фрагментируют и лигируют к фрагментам адаптеры
Фрагмент закрепляется на микро-шарике, покрытой олигонуклеотидами, комплементарными концам адаптера
Шарики с ДНК смешивают с эмульсией, содержащей ДНК- полимеразу и dNTP и проводят ПЦР

454 – принцип метода
Носитель – плашка с множеством (> 1 000
000) лунок
В лунки загружаются шарики, на которых закреплены фрагменты ДНК
Также в лунки помещаются частицы с закрепленными на них ферментами – АТФ- сульфурилазой и люциферазой

454 – принцип метода
Через лунки в пропускают
заданном реагенты
порядке (dNTP,
люциферин, аденозинфосфосульфат)
При присоединении dNTP выделяется пирофосфат. Сульфурилаза преобразует пирофосфат + аденозинфосфосульфат в АТФ. АТФ используется для окисления люциферина люциферазой. Световой сигнал регистрируется фотокамерой.

Секвенирование Illumina - принцип метода
1. ДНК фрагментируют и
лигируют к фрагментам адаптеры
2. ДНК ячейки,
пропускают покрытые
через каналы праймерами,
комплементарными концам адаптеров
3. Через ячейку пропускают реагенты для достраивания второй цепи ДНК
4. Двуцепочечные
фрагменты
денатурируют
Стадии 3-4 повторяются 30-35 раз
6. Каждый фрагмент оказывается окружен группой идентичных молекул («кластеры»).

Секвенирование Illumina - принцип метода
7. Через ячейку пропускают реагенты (флуоресцентно меченые терминированные dNTP и полимеразу)
8. На ячейку светят лазером и проводят съемку.
9. Через ячейку пропускают реагенты, отщепляющие флуорофор и терминатор
10. Повторение 7-9 нужное число раз (50- 300). Число циклов соответствует длине
чтения.

Преимущества:
•высокая точность
•универсальность
•доступность ПО для обработки и анализа результатов
•наименьшая цена получаемых данных (в расчете на нуклеотид)
Недостатки
высокая цена реагентов
•проблемы с секвенированием матриц с низкой сложностью
большая длительность прогона
ошибки в GC-богатых участках
Illumina – преимущества и недостатки

Секвенирование путем лигирования (SOLiD)
Преимущества:
высокая точность
возможность использовать часть дорожек на ячейке Недостатки
очень короткие чтения
длительность работы
относительно малая доступность свободного ПО

Полупроводниковое секвенирование
Самая новая из технологий cеквенирования 2 поколения Сходно с 454-секвенированием, но регистрируется не свет, а pH
Преимущества:
относительно низкая цена за запуск
быстрота
цена за запуск/цена за Мб (в $)
939/0.60
1 000/0.02
время работы
7 часов
при длине 400
4 часа
Недостатки
невысокая точность прочтения гомополимерных участков
низкая производительность

Бисульфитті секвенирлеу
Бисульфитті секвенирлеу - бисульфитпен өңдеу арқылы ДНҚ метилдеу паттернасын зерттеуге бағытталған әдістер тобының жалпы атауы.

Бисульфит цитозинді урацилға айналдыра отырып, бір тізбекті ДНҚ-ға әсер етеді. Егер осы цитозин метилденген болса, яғни оның бесінші Атом көміртегіне метильді топ қосылған болса, онда мұндай цитозин айналуға ұшырамайды.
Осылайша, бисульфит ДНҚ реттілігін оның метилдеу паттерніне байланысты өзгертеді және оның әсерінен кейін CpG-динуклеотидтердің метилденген екенін анықтауға болады.

Бисульфитті секвенирлеудің бірінші әдісі 1992 жылы сипатталған. Метилдеу паттернін анықтау үшін ПЦР қолданылды, ол үшін праймерлер өзгертілген және өзгермеген бисульфит ДНҚ-ға тән болды, яғни олар CPG-динуклеотидтерге кіретін цитозиндер жоқ. Праймерлер үшін метилдеу сайтына жақын, бірақ оны қамтымайтын учаскелер пайдаланылды.
Цитозин метилденбеген жағдайда амплифицирленген ретпен тимин (урацил), ал синтезделген комплементарлық ретпен аденин табылды. Егер цитозин метилденсе, онда амплифицирленген тізбекте ол қалды, ал комплементарлы синтезде гуанин қалды. Мұндай әдіс өте қиын, өйткені ПТР өнімдерін қажетті сезімталдыққа жету үшін клондауды талап етеді. Осы мәселені салынған ПТР көмегімен шешуге болады.

Бисульфитті секвенирлеу әдістері бірқатар шектеулерге ие. Сүтқоректілерде ДНҚ 5-гидроксиметилцитозин модификациясы кең таралған. Бисульфитпен өңдеу кезінде 5-гидроксиметилцитозин цитозин-5-метилсульфонатқа айналады, ол секвенирлеу кезінде ц деп танылады. Осылайша, бисульфитті секвенирлеу 5-гидроксиметилцитозин мен метилцитозинді ажырата алмайды, сондықтан ДНҚ метилденуіне ғана сезімтал әдіс ретінде қарастырыла алмайды.