Экпрессия белков, регулирующих прохождение фазы G1 клеточного цикла,

Общая схема прохождения клеткой фазы G1

Попов Б., Пeтрова Е., Рябов В. «Уровень Cdc25A, формирующей контрольную точку R1, стабилизируется в клетках аденокарциномы кишечника HCT116 деубиквитиназой Usp28»

Целью данной работы было изучение роли белков Usp28, Cyclin E, Cyclin D1, Cdk4, Cdk2 и E2F1 в развитии аденокарциномы кишечника человека на клетках линии -HCT116 и с ингибированной деубиквитиназой – H5
Задачи:
С помощью иммунофлуоресцентного анализа (ИФА) определить изменение экспрессии Cyclin E, Cyclin D1, Cdk4, Usp28 и E2F1 в ходе клеточного цикла в As и 12h точке
С помощью иммуноблотинга определить изменение уровней Usp28, Cyclin E, Cyclin D1, Cdk4, Cdk2 и E2F1 в ходе клеточного цикла
Охарактеризовать по уровню продукции в клетках Usp28 возможную взаимосвязь между Usp28 и Cyclin E, Cyclin D1, Cdk4 , Cdk2 и E2F1

Cyclin D1
E2F1
Cdk4
Cпецифические антитела
Совмещенные изображения
(специфические антитела+DAPI
Cyclin D1
E2F1
Cdk4
Cyclin E
Совмещенные изображения
(специфические антитела+DAPI
Cпецифические антитела
HCT116 - G1/S - As
H5 - G1/S - As
Иммунофлюоресцентная оценка экспрессии исследуемых белков в клетках HCT116 и Н5 в As точке
Рис.1. Экспрессия белков Cyclin E, Cyclin D1, Cdk4 и E2F1 в HCT116 и H5 клетках в As точке по данным ИФА
Usp28
Cyclin E
Usp28

HCT116 - G1/S - 12h
Cyclin D1
E2F1
Cdk4
Cyclin E
Cпецифические антитела
Совмещенные изображения
(специфические антитела+DAPI
Cyclin D1
E2F1
Cdk4
Cyclin E
Совмещенные изображения
(специфические антитела+DAPI
Cпецифические антитела
Usp28
Usp28
H5 - G1/S - 12h
Иммунофлюоресцентная оценка экспрессии исследуемых белков в клетках HCT116 и Н5 в точке G1/S
Рис.2. Экспрессия белков Cyclin E, Cyclin D1, Cdk4 и E2F1 в HCT116 и H5 клетках в 12h точке по данным ИФА

Рис.3 Иммуноблот продукции Usp28, Cyclin E, Cyclin D1, Cdk4 и E2F1 в клетках H5 в As точке
Оценка продукции исследуемых белков в клетках H5 с помощью иммуноблота

Рис.4 а- Иммуноблот продукции E2F1 в клетках H5 и HCT116, б- графическое представление экспрессии Usp28, CycE, cdk2 в клетках H5 и HCT116 по данным вестерн-блота
(а)
(б)
Оценка продукции исследуемых белков в клетках HCT116 и H5 с помощью иммуноблота

Рис.5 a- Иммуноблот продукции Usp28, CycE, cdk2 в клетках H5 и HCT116, б- графическое представление экспрессии Usp28, CycE, cdk2 в клетках H5 и HCT116 по данным вестерн-блота
(а)
(б)
Оценка продукции исследуемых белков в клетках HCT116 и H5 с помощью иммуноблота

Выводы:
1) По результатам ИФА экспрессия исследуемых белков ярко выражена в клетках HCT116.
2) По результатам WB в клетках с ингибированной деубиквитиназой Usp28, продукция исследуемых белков выражена слабо, по сравнению с материнской линией.
3) Наблюдается прямая зависимость между изменением количества экспрессируемой деубиквитиназы и исследуемых белков в ходе клеточного цикла в фазе перехода G1/S.
Результаты дают основание предположить, что деубиквитиназа Usp28 способствует переходу G1/S в клеточном цикле, стимулируя пролиферацию клеток и ускоряя развитие злокачественной опухоли.
Таким образом, с большой вероятностью можно предположить, что деубиквитиназу Usp28 следует рассматривать как наиболее перспективный кандидат на мишень для новой таргетной фармакотерапии аденокарциномы кишечника.