Характеристика вирусов. Бактериофаги

Камышева К.С. Основы микробиологии и иммунологии Уч. пособие. «Феникс», 2015 г с.244-257 Подготовка реферативного сообщения по теме: «Применение бактериофагов в медицине».

Открытие вирусов Д.И.Ивановским в 1892г. положило начало развитию науки вирусологии. Более быстрому ее развитию способствовали: изобретение электронного микроскопа, разработка метода культивирования микроорганизмов в культурах клеток.

Слово “вирус” в переводе с латинского- яд (животного происхождения). Этот термин применяют для обозначения уникальных представителей живой природы, не имеющих клеточного (эукариотического или прокариотического) строения и обладающих облигатным внутриклеточным паразитизмом, т.е. которые не могут жить без клетки.

В настоящее время вирусология- бурно развивающаяся наука, что связано с рядом причин:
- ведущей ролью вирусов в инфекционной патологии человека (примеры- вирус гриппа, ВИЧ- вирус иммунодефицита человека, цитомегаловирус и другие герпесвирусы) на фоне практически полного отсутствия средств специфической химиотерапии;
- использованием вирусов для решения многих фундаментальных вопросов биологии и генетики.

Основные свойства вирусов (и плазмид), по которым они отличаются от остального живого мира.
1.Ультрамикроскопические размеры (измеряются в нанометрах). Крупные вирусы (вирус оспы) могут достигать размеров 300 нм, мелкие- от 20 до 40 нм. 1мм=1000мкм, 1мкм=1000нм.
2.Вирусы содержат нуклеиновую кислоту только одного типа- или ДНК (ДНК- вирусы) или РНК (РНК- вирусы). У всех остальных организмов геном представлен ДНК, в них содержится как ДНК, так и РНК.

3.Вирусы не способны к росту и бинарному делению.
4.Вирусы размножаются путем воспроизводства себя в инфицированной клетке хозяина за счет собственной геномной нуклеиновой кислоты.
5.У вирусов нет собственных систем мобилизации энергии и белок- синтензирующих систем, в связи с чем вирусы являются абсолютными внутриклеточными паразитами.

6.Средой обитания вирусов являются живые клетки- бактерии (это вирусы бактерий или бактериофаги), клетки растений, животных и человека.
Все вирусы существуют в двух качественно разных формах: внеклеточной- вирион и внутриклеточной- вирус.
Таксономия этих представителей микромира основана на характеристике вирионов- конечной фазы развития вирусов.

Классификация и таксономия вирусов.
Вирусы составляют царство Vira, которое подразделено по типу нуклеиновой кисло­ты на два подцарства — рибовирусы и дезоксирибо-вирусы.
Полцарства делятся на семейства, которые в свою очередь подразделяются на роды. Понятие о виде вирусов пока еще четко не сформулировано, так же как и обозначение раз­ных видов.

В качестве таксономических характеристик первостепенное значение придается типу нуклеиновой кислоты и ее молекулярно-биологическим признакам: двунитевая, однонитевая и др. и следующие признаки:
-морфология,
-структура и размеры вириона,
- наличие или отсутствие внешней оболочки (суперкапсида),
-антигены,
-внутриядерная или цитоплазматическая локали­зация и др.
Наряду с упомянутыми признаками учитываются резистентность к температуре, рН, детергентам и т. д.

В настоящее время вирусы человека и животных включены в состав 18 семейств (табл. 1,2).
Таблица 1.
Классификация ДНК-геномных вирусов

Строение (морфология) вирусов.

1.Геном вирусов образуют нуклеиновые кислоты, представленные одноцепочечными молекулами РНК (у большинства РНК- вирусов) или двухцепочечными молекулами ДНК (у большинства ДНК- вирусов).
2.Капсид - белковая оболочка, в которую упакована геномная нуклеиновая кислота.
Капсид состоит из идентичных белковых субъединиц- капсомеров. Существуют два способа упаковки капсомеров в капсид- спиральный (спиральные вирусы) и кубический (сферические вирусы).

При спиральной симметрии белковые субъединицы располагаются по спирали, а между ними, также по спирали, уложена геномная нуклеиновая кислота (нитевидные вирусы). При кубическом типе симметрии вирионы могут быть в виде многогранников, чаще всего- двадцатигранники - икосаэдры.

3.Просто устроенные вирусы имеют только нуклеокапсид, т.е. комплекс генома с капсидом и называются “голыми”.
4. У других вирусов поверх капсида есть дополнительная мембраноподобная оболочка, приобретаемая вирусом в момент выхода из клетки хозяина- суперкапсид. Такие вирусы называют “одетыми”.

ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ ВИРИОНОВ
В состав простых вирионов входит один тип нуклеиновой кис­лоты — РНК или ДНК — и белки.
У сложных вирионов в составе внешней оболочки содержатся липиды и полисахариды, которые они получают из клеток хозяина.

Основные этапы взаимодействия вируса с клеткой хозяина.
1.Адсорбция - пусковой механизм, связанный со взаимодействием специфических рецепторов вируса и хозяина (у вируса гриппа - гемагглютинин, у вируса иммунодефицита человека- гликопротеин gp 120).

2.Проникновение - путем слияния суперкапсида с мембраной клетки или путем эндоцитоза (пиноцитоза).
3.Освобождение нуклеиновых кислот - “раздевание” нуклеокапсида и активация нуклеиновой кислоты.

4.Синтез нуклеиновых кислот и вирусных белков, т.е. подчинение систем клетки хозяина и их работа на воспроизводство вируса.
5.Сборка вирионов - ассоциация реплицированных копий вирусной нуклеиновой кислоты с капсидным белком.
6.Выход вирусных частиц из клетки, приобретения суперкапсида оболочечными вирусами.

Исходы взаимодействия вирусов с клеткой хозяина.
1.Абортивный процесс - когда клетки освобождаются от вируса:
- при инфицировании дефектным вирусом, для репликации которого нужен вирус- помощник, самостоятельная репликация этих вирусов невозможна ( так называемые вирусоиды). Например, вирус дельта (D) гепатита может реплицироваться только при наличии вируса гепатита B, его Hbs - антигена, аденоассоциированный вирус- в присутствии аденовируса);
- при инфицировании вирусом генетически нечувствительных к нему клеток;
- при заражении чувствительных клеток вирусом в неразрешающих условиях.

2.Продуктивный процесс - репликация (продукция) вирусов:
- гибель (лизис) клеток (цитопатический эффект)- результат интенсивного размножения и формирования большого количества вирусных частиц - характерный результат продуктивного процесса, вызванного вирусами с высокой цитопатогенностью. Цитопатический эффект действия на клеточные культуры для многих вирусов носит достаточно узнаваемый специфический характер;
- стабильное взаимодействие, не приводящее к гибели клетки (персистирующие и латентные инфекции) - так называемая вирусная трансформация клетки.

3.Интегративный процесс - интеграция вирусного генома с геномом клетки хозяина. Это особый вариант продуктивного процесса по типу стабильного взаимодействия.
Вирус реплицируется вместе с геномом клетки хозяина и может длительно находиться в латентном состоянии.
Встраиваться в ДНК - геном хозяина могут только ДНК - вирусы (принцип “ДНК- в ДНК”).
Единственные РНК - вирусы, способные интегрироваться в геном клетки хозяина - ретровирусы, имеют для этого специальный механизм.
Особенность их репродукции - синтез ДНК провируса на основе геномной РНК с помощью фермента обратной транскриптазы с последующим встраиванием ДНК в геном хозяина.

Методы культивирования вирусов.
Вирусы являются облигатными внутриклеточными паразитами, потому они могут репродуцироваться только в живой клетке. Исходя из этого, предложены три основных способа
Основные методы культивирования вирусов.
1.В организме лабораторных животных.
2.В куриных эмбрионах.
3.В клеточных культурах - основной метод.

Вирусы бактерий (бактериофаги).
В 1917 г. французский микробиолог Д'Эррель изучал возбу­дителя дизентерии, наблюдал лизис бактериальной культуры при внесении в нее фильтрата испражнений больных людей.
Лизирующее начало сохранялось при многократном пассиро­вании культуры дизентерийных бактерий и даже становилось более активным. Агент, растворяющий бактерии, автор называл бактериофагом («пожиратель» бактерий от лат. pha-gos — пожирающий), а действие бактериофага, заканчивающе­еся лизисом бактерий, — феноменом бактериофагии.

Вместе с тем Д'Эррель правильно оценил биологический смысл открытого им феномена.
Он высказал предположение, что бактериофаг является инфекционным агентом, лизирующим бактерии, вследствие чего в окружающую среду поступают дочерние фаговые частицы.
На твердых средах, засеянныхсмесью фага с бактериальной культурой, в местах лизиса бак­терий появляются стерильные пятна или негативные колонии фагов.

Посев этой же бактериальной культуры на жидкую среду приводит к просветлению среды.
Позднее было показано, что фа­ги являются бактериальными вирусами, имеющими в качестве хозяев бактерии определенных видов.

Номенклатура бактериофа­гов основана на видовом наименовании хозяина. Например, фаги, лизирующие дизентерийные бактерии, получили название ди­зентерийных бактериофагов, сальмонеллы — сальмонеллезных бактериофагов, дифтерийные бактерии — дифтерийных бактери­офагов и т. д.

Структура. Большинство фагов имеют сперматозоидную форму. Они состоят из головки, которая содержит нуклеиновую кислоту, и отростка.
У некоторых фагов отросток очень корот­кий или вовсе отсутствует.
Размеры фаговой частицы колеблются от 20 до 200 нм. Средний диаметр головки равен 60—100 нм, длина отростка 100—200 нм.

Химический состав. Фаги, как и другие вирусы, состоят из нуклеиновой кислоты и белка.
Большинство их них содержат двунитевую ДНК, которая замкнута в кольцо.

Резистентность к факторам окружающей среды. Фаги более устойчивы к действию физических и химических факторов, чем многие вирусы человека.
Большинство из них инактивируются при температуре свыше 65°—70 °С. Они хорошо переносят за­мораживание и длительно сохраняются при низких температурах и высушивании.
Сулема (0,5% раствор), фенол (1 % раствор) не оказывают на них инактивирующего действия.
В то же время 1 % раствор формалина инактивирует фаг через несколь­ко минут.
Ультрафиолетовые лучи и ионизирующая радиация также вызывают инактивирующий эффект, а в низких дозах — мутации.

Естественной средой обитания фагов является бактериальная клетка, поэтому фаги распространены повсеместно (например, в сточных водах). Фагам присущи биологические особенности, свойственные и другим вирусам.
Наиболее морфологически распространенный тип фагов характеризуется наличием головки- икосаэдра, отростка (хвоста) со спиральной симметрией (часто имеет полый стержень и сократительный чехол), шипов и отростков (нитей), т.е. внешне несколько напоминают сперматозоид.
Взаимодействие фагов с клеткой (бактерией) строго специфично, т.е. бактериофаги способны инфицировать только определенные виды и фаготипы бактерий.

Основные этапы взаимодействия фагов и бактерий.
1.Адсорбция (взаимодействие специфических рецепторов).
2.Внедрение вирусной ДНК (инъекция фага) осуществляется за счет лизирования веществами типа лизоцима участка клеточной стенки, сокращения чехла, вталкивания стержня хвоста через цитоплазматическую мембрану в клетку, впрыскивание ДНК в цитоплазму.
3.Репродукция фага.
4.Выход дочерних популяций.

Основные свойства фагов.
Антигенные свойства.
Бактериофаги содержат группоспецифи­ческие и типоспецифические антигены, обладают иммуногенными свойствами, вызывая синтез специфических антител в организме.
Антитела, взаимодействуя с бактериофагами, могут нейтрализовать их литическую активность в отношении бактерий. По типоспеци­фическим антигенам фаги делят на серотипы.

Различают вирулентные фаги, способные вызвать продуктивную форму процесса, и умеренные фаги, вызывающие редуктивную фаговую инфекцию (редукцию фага).
В последнем случае геном фага в клетке не не реплицируется, а внедряется (интегрируется) в хромосому клетки хозяина (ДНК в ДНК), фаг превращается в профаг. Этот процесс получил название лизогении.
Если в результате внедрения фага в хромосому бактериальной клетки она приобретает новые наследуемые признаки, такую форму изменчивости бактерий называют лизогенной (фаговой) конверсией.

Бактериальную клетку, несущую в своем геноме профаг, называют лизогенной, поскольку профаг при нарушении синтеза особого белка- репрессора может перейти в литический цикл развития, вызвать продуктивную инфекцию с лизисом бактерии.

Умеренные фаги имеют важное значение в обмене генетическим материалом между бактериями- в трансдукции (одна из форм генетического обмена). Например, способностью вырабатывать экзотоксин обладают только возбудитель дифтерии, в хромосому которого интегрирован умеренный профаг, несущий оперон tox, отвечающий за синтез дифтерийного экзотоксина.
Умеренный фаг tox вызывает лизогенную конверсию нетоксигенной дифтерийной палочки в токсигенную.

По спектру действия на бактерии фаги разделяют на :
- поливалентные (лизируют близкородственные бактерии, например сальмонеллы);
- моновалентные (лизируют бактерии одного вида);
- типоспецифические (лизируют только определенные фаговары возбудителя).

На плотных средах фаги обнаруживают чаще с помощью спот (spot) - теста (образование негативного пятна при росте колоний) или методом агаровых слоев (титрования по Грациа).

Практическое использование бактериофагов.
1.Для идентификации (определение фаготипа).
2.Для фагопрофилактики (купирование вспышек).
3.Для фаготерапии (лечение дисбактериозов).
4.Для оценки санитарного состояния окружающей среды и эпидемиологического анализа