Конъюгация. F-плазмида

F-плазмида
F-плазмида кодирует все белки, необходимые для конъюгации. Также имеются:
ориджин для тета-репликации, второй ориджин (слабый) и третий, неактивный, в который внедрился Tn1000,
система Par,
cистемы, убивающие бактериальную клетку, если в ней нет F-плазмиды,
система, блокирующая развитие бактериофага Т7,
система, блокирующая хозяйскую SOS-репарацию, что сильно облегчает существование плазмиды внутри бактерии.
Функции многих генов неизвестны до сих пор.

Гены tra F-плазмиды
Dtr-гены, или Dtr-компоненты
(DNA Transfer and Replication).
Необходимы для процессинга плазмиды при подготовке ее к конъюгациии.
Mpf-гены, или Mpf-компоненты
(Mating Pair Formation).
Продукты экспрессии этих генов формируют сложный комплекс, ассоциированный с бактериальными мембранами, способствующий ассоциации двух бактериальных клеток. Через него, собственно, и происходит перенос плазмиды из клетки в клетку.

Аппарат переноса F-плазмиды из клетки в клетку
Основной компонент аппарата – пилус, структура, скрепляющая друг с другом клетки донора и акцептора. Пилус состоит из многих молекул белка TraA, или пилина. Он может нарастать (во время поиска реципиента) и сокращаться в длине (для сближения клеток донора и реципиента).
Пилин в зрелой форме ковалентно замкнут через N- и С-концы!
К несчастью, времени подробно рассмотреть структуру данной поры у нас нет.

Сцепляющие белки (coupling proteins)
Белки – компоненты Mpf-аппарата, осуществляющие его связь с Dtr-аппаратом и сигнализирующие ему о том, что пора готовить плазмиду к конъюгации.
В случае F-плазмиды сцепляющий белок – это TraD.
Этот белок закреплен в мембране и помогает молекуле плазмиды войти в канал и пройти его, достигая клетки-реципиента.

Dtr-аппарат
Состоит из нескольких белков, осуществляющих разные функции.
Релаксаза (TraI в случае F-плазмиды) является частью большого белкового комплекса – релаксосомы, в который еще входят вспомогательные Tra-белки.
Релаксаза связывается в районе oriT и делает одноцепочечный разрыв (ник). 5’-концевой фосфат переносится на тирозин белка.
Плазмида расплетается, и никированная цепочка вместе с релаксазой проникает в клетку-реципиент при помощи Mpf-аппарата.
В реципиенте релаксаза осуществляет обратную реакцию, замыкая одноцепочечную ДНК в кольцо. После этого она отваливается от ДНК, приходит в негодность и деградирует.

Работа Dtr-аппарата
Клетка-донор и клетка-реципиент находятся неподалеку друг от друга.
Собирается Mpf-структура, образуется пара «брачующихся» клеток.
Сцепляющие белки привлекают релаксазу, вносящую ник, и хеликазу.

Работа Dtr-аппарата
Релаксаза и хеликаза в комплексе с одной из цепочек плазмиды проникают в клетку-реципиент.
Релаксаза восстанавливает целостность цепочки ДНК в реципиенте. В дело вступает праймаза (либо закодирована в плазмиде и проникает в реципиента вместе с ДНК, либо закодирована в хозяйской клетке), создающая затравку для репликации в реципиенте. В качестве затравки для репликации в доноре часто выступает 3’-конец никированной цепочки, который все еще находится в доноре.
По завершении репликации в обеих клетках содержатся по двуцепочечной плазмиде. «Брачующаяся» пара распадается. Дело сделано!

Регуляция конъюгации
Процесс конъюгации обычно эффективен только в первое время после того, как плазмида попала в клетку-донор. Это связано с тем, что большую часть времени экспрессия большинства генов Tra подавлена. Механизмов подавления много, мы рассмотрим только нашу любимую F-плазмиду.
Практически сразу после oriT в плазмидной ДНК начинаются гены Tra. Как только плазмида попала в клетку и достроилась, все экспрессируется. В том числе, и ген traJ, кодирующий транскрипционный активатор промотора PtraY, c которого экспрессируются все гены, необходимые для формирования пилуса. Причем эта экспрессия возможна даже пока еще плазмида находится в одноцепочечной форме.

Регуляция конъюгации
Итак, пилус сформировался, следующий акт конъюгации возможен. Однако же тем временем вновь попавшая в клетку плазмида стала двуцепочечной! Это позволяет начать работать промотору PfinP, с которого синтезируется короткая РНК FinP. Она комплементарна инициаторному участку мРНК TraJ, связывается с этим участком и блокирует ее трансляцию. TraJ не синтезируется, экспрессия остальных Tra-генов подавляется. А еще есть белок FinO, стабилизирующий РНК FinP и помогающий ее формировать стабильный дуплекс с мРНК TraJ.
Впервые описанная F-плазмида содержала мутантный ген finO со встроенным транспозоном. Белок FinO был неактивен, в результате чего вышеописанная система не работала, и бактериальные клетки с такой плазмидой почти всегда имели пилус и были готовы к конъюгации. На самом деле, только благодаря этому ее и открыли!

Бактериальный промискуитет
Перенос плазмиды из бактерию в бактерию другого вида – рядовое событие.
Существует класс плазмид, которые называются плазмидами промискуитета. Они в норме присутствуют в клетках E.coli и могут легко переноситься в любые грам-отрицательные бактерии, а с невысокой частотой – в цианобактерии, грам-положительные бактерии и даже в клетки высших растений!
Обыкновенная F-плазмида при определенных условиях может перейти из клетки E.coli в клетку пекарских дрожжей.
Плазмиды промискуитета играют важную роль в эволюции, а также являются одной из основных причин быстрого распространения устойчивости к антибиотикам среди бактерий.

Мобилизуемые плазмиды
Это такие плазмиды, которые могут перенестись из клетки в клетку только при помощи другой плазмиды, а сами по себе не могут.
Мобилизуемые плазмиды должны содержать oriT и ген релаксазы, а вот сцепляющих белков они не кодируют.
В процессе мобилизации Dtr- и Mpf-системы мобилизующей плазмиды работают в двойственном режиме: in cis и in trans.
Чаще всего при конъюгации из клетки в клетку переходит только одна плазмида, другая не успевает. В случае, показанном на рисунке, это с равной вероятностью может быть либо мобилизующая, либо мобилизуемая плазмида. Таким образом, мы имеем дело с отличным примером молекулярно-генетического альтруизма со стороны мобилизующей плазмиды.

Плазмидный перенос хромосом
Этот процесс происходит в тех случаях, когда самопереносящаяся пладмида интегрируется в геном бактерии. При переходе в другую клетку такая плазмида забирает хромосому с собой.
Интеграция чаще всего происходит при помощи гомологичной рекомбинации. Например, наша любимая F-плазмида часто содержит короткие вставочные элементы (IS2), которые встречаются и в хромосомной ДНК. Тогда между ними может произойти рекомбинация.
Штаммы со встроенной в хромосому плазмидой называются Hfr (High Frequency Recombination).

Прайм-факторы
Перенос из клетки в клетку целой хромосомы в виде плазмиды – редкое событие. Чаще случается так, что при рекомбинации в перемещающуюся плазмиду попадает часть хромосомы. Такие плазмиды называют прайм-факторами.
F-плазмида, содержащая часть бактериальной хромосомы, обозначается как F’ (F-prime).
Образование прайм-фактора сопровождается
делециями в хромосомной ДНК бактерии.
ВАЖНАЯ ЭВОЛЮЦИОННАЯ РОЛЬ!!!

Конъюгация у грам-положительных бактерий
В целом организована так же, как и у грам-отрицательных, однако имеются интересные отличительные черты, а именно использование бактериальных феромонов (рассмотрим на примере энтерококков).
Клетка-реципиент: в хромосомной ДНК закодировано несколько олигопептидов, напоминающих феромоны (для примера показаны cAD1 и cCF10). После процессинга они экспортируются во внеклеточное пространство.

Конъюгация у грам-положительных бактерий
Клетка-донор содержит плазмиду pAD1, с которой синтезируется белок TraA – транскрипционный репрессор, подавляющий экспрессию остальных генов Tra и некоторых других. Экспрессируются только гены traB и traC, кодирущие ингибиторный белок (о нем ниже) и рецептор для феромона сAD1, соответственно.

Конъюгация у грам-положительных бактерий
Феромон cAD1 связывается с TraC и проникает внутрь клетки-донора через специальную транспортную систему Opp. В клетке он связывается с белком TraA, который теперь уже не может репрессировать транскрипцию, и та начинается. Синтезируются все Tra-белки, необходимые для конъюгации, а также белок Asa, способствующий агрегации двух клеток.

Конъюгация у грам-положительных бактерий
Собственно конъюгация происходит практически так же, как и у грам-отрицательных бактерий. Плазмида pAD1 переходит из донора в реципиента.

Конъюгация у грам-положительных бактерий
Выключение конъюгации у трансконъюгантов происходит по нескольким механизмам.
Олигопептид iAD1, закодированный в плазмиде, выходит наружу и связывается с TraC, блокируя его и не давая связаться с феромоном, пришедшим из другой клетки.
Тот самый белок TraB связывает феромон cAD1 и не дает ему выйти наружу.
Таким образом, трансконъюгант какое-то время не компетентен в pAD1-конъюгации ни как донор, ни как реципиент. При этом pCF10-конъюгация возможна!

Конъюгация у грам-положительных бактерий:
интегративные конъюгирующие элементы (ICE)
ICE не способны к автономной репликации, то есть это не плазмиды. Однако они могут вырезаться из генома одной бактерии и встраиваться в геном другой.
Сразу после их открытия ICE считали большими транспозонами, поэтому многие из них называются Tn… Однако механизм мобильности ICE абсолютно не такой, как механизм мобильности транспозонов.
ICE – промискуитетные генетические элементы, способные встраиваться в геномы множества грам+ и некоторых грам- бактерий.
Канонический ICE: энтерококковый Tn916.

Самовырезание Tn916.
Белки Int и Xis вносят разрывы в хромосому неподалеку от границ ICE. Образуются липкие концы, которые на самом деле не липкие, поскольку не комплементарны друг другу. Однако по неизвестному механизму вырезанный ICE все же сворачивается в кольцо и самолигируется с образованием короткого неспаренного участка. Кольцевая форма не способна к репликации, но зато только с нее могут начать экспрессироваться гены ICE, продукты которых и организуют конъюгацию по механизму, очень напоминающему Tra-механизм плазмид.

Самовстраивание Tn916.
Перед конъюгацией кольцевой ICE никируется, и одна цепочка ICE проникает в реципиента. Там на ее матрице достраивается вторая цепочка, и двуцепочечный ICE снова самолигируется.
Наконец, белок Int встраивает ICE в хромосому реципиента по механизму, очень напоминающему таковой у бактериофагов (о нем мы поговорим позднее).

Трансформация
Трансформацией называется процесс поглощения бактериальной клеткой ДНК из внешней среды.
Способность поглощать ДНК из внешней среды называется компетентностью.
Природная компетентность
Бактерия способна к трансформации сама по себе, без какой-либо дополнительной подготовки
(такая компетентность обычно свойственна бактериям только на отдельных этапах жизненного цикла или в определенных условиях).
Индуцированная компетентность
Бактерия становится способна к трансформации после специальной подготовки (обработка раствором солей, электрический разряд…)
Это относится к области генной инженерии, об этом у нас, к сожалению, говорить времени нет.

Природная компетентность грам-положительных бактерий (B. subtilis)
Com-аппарат состоит из белков ComG (формирует пилус), ComEA (рецептор для сиквенс-неспецифического связывания ДНК), ComEC и ComFА (формируют канал в мембране). Двуцепочечная ДНК связывается с ComEA, после чего в дело вступает внеклеточная нуклеаза (которая, кстати, идентифицирована далеко не у всех природно-компетентных грам+ бактерий) и съедает одну из цепочек ДНК. Оставшаяся одноцепочечная ДНК проникает в клетку, где с ней связывается белок SSB. В дальнейшем ДНК может (1) интегрироваться в геном при помощи рекомбинации, (2) превратиться в двуцепочечную плазмиду, (3) деградировать.

Природная компетентность грам-отрицательных бактерий (N. gonorrhoeae)
Все примерно то же самое, только для транспорта через внешнюю мембрану используется система секреции с основным компонентом – белком секретином.

Регуляция компетентности у B. subtilis
Компетентность у этой бактерии проявляется в момент истощения ресурсов. Истощение сопровождается накоплением пептида ComX во внешней среде. Это чувствует белок ComР, который в связи с этим самофосфорилируется. Фосфат передается на белок ComA, что позволяет последнему активировать транскрипцию гена comK. Белок ComK, в свою очередь, активирует транскрипцию остальных Com-генов, что приводит к наведению компетентности.
Параллельно с этим, снаружи накапливается пептид CSF, который, когда его много, способен проникать обратно в клетку и служить косвенным активатором белка ComA, поскольку он инактивирует некую клеточную фосфатазу, которая иначе с удовольствием дефосфорилировала бы белок ComA.
В поздней культуре B. subtilis всего около 10% клеток компетентны. Эти клетки как бы ждут, пока погибнут остальные 90%, чтобы захватить их ДНК. Это, в свою, очередь, даст им дополнительные возможности выжить в условиях недостатка питания.