Лазерная интерференционная микроскопия для исследования живых клеток

Использование различных методов микроскопии для исследования биологических объектов
Для получения хорошего разрешения, как правило, приходится прибегать к использованию красителей. Тяжело численно определять толщину объектов.
Не работает с живыми объектами
(для атомно-силовой микроскопии)
Неспособна хорошо работать с клетками мягких тканей (например, нервными) . Более сложна при обучении.

Биологические объекты, как правило,
бесцветны и обладают низким контрастом
для их визуализации необходимо
Увеличить контраст можно за счет увеличения интенсивности отдельных участков клетки
(например использование красителей — увеличивается различие интенсивности между соседними окрашенными и неокрашенными органеллами клетки)
Также можно увеличить контраст изображения за счет регистрации изменения фазы образца и ее преобразования в видимое глазом изменение амплитуды
Это позволяет получить изображение живых объектов с их минимальными модификациями
улучшение контраста
Лазерная интерференционная микроскопия (ЛИМ) относится к таким методам

Помимо увеличения контраста и разрешения лазерная интерференционная микроскопия позволяет количественно оценить изменения показателя преломления и толщины биологических объектов, пропорциональные оптической плотности образцов
(то есть, используя ЛИМ можно получать функциональные изображения объектов, аналогично атомно-силовой микроскопии)
Таким образом можно получать трехмерные изображения объектов, причем высота в каждой точке объекта будет пропорциональна локальному изменению оптической плотности
Особенности ЛИМ

Луч лазера, являющегося источником освещения, разделяется на два луча: луч проходящий через образец и контрольный луч, используемый для сравнения.
В детекторе эти два луча интерферируют между собой. Поскольку лучи проходят через разные оптические среды, они имеют разную скорость продвижения, т. е. происходит сдвиг фазы. Таким образом за одно и тоже время лучи проходят различный оптический путь
Основные принципы ЛИМ
Величина ОРХ, пропорциональна показателю преломления и толщине образца. Значение фазовой высоты зависит от размеров и свойств образца

Разрешение ЛИМ
Латеральное разрешение определяется, аналогично традиционным оптическим микроскопам, критереем разрешения Релея и составляет величину около 0,5 мкм.
Вертикальное разрешение может достигать величины порядка 1 нм.
Коллоиды серебра в физиологическом растворе

3D форма объекта отличается от его 3D фазового изображения!
Экспериментально измеряемая при помощи ЛИМ оптическая разность хода (ОРХ), или фазовая высота, в каждой точке плоскости объекта представляет из себя сумму произведений показателя преломления на толщину различных оптических сред в этой точке (напр. клеточных органелл). z и n– толщина и показатель преломления оптической среды, соответственно:
Особенности отображения биологических объектов при помощи ЛИМ

Особенности отображения биологических объектов при помощи ЛИМ
сечение реального объекта
сечение фазового портрета
однородные клетки сферической или цилиндрической формы
однородные клетки более сложной формы (эритроциты)
гетерогенные объекты (большинство клеток в том числе нейроны пиявки и прудовика)

Интерпретация изменения фазовой высоты
Если известно изменение величины толщины (объема) то можно оценить изменение показателя преломления объекта. Изменение показателя преломления свидетельствует об изменении свойств объекта

n0- показатель преломления среды
Связь ОРХ с количеством вещества
Показатель преломления связан с концентрацией (m/V)
α- экспериментально определяемый коэффициент, зависящий от рода вещества
В упрощенном виде объем есть произведение площади, S, на толщину, z
При этом величина ОРХ пропорциональна концентрации вещества, а произведение ОРХ на площадь пропорционально количеству вещества
α – зависит от показателей преломления вещества и среды, а также от удельной плотности вещества, ρ

Показатель преломления связан с концентрацией
Зная объем объекта можно рассчитать его показатель преломления
Зная показатель преломления объекта можно рассчитать его показатель преломления
Из измеряемых параметров средней величины ОРХ и площади можно рассчитать количество вещества в клетке
Основные используемые формулы

Определение размеров клеток
Один из наиболее простых способов оценки состояния эритроцитов это оценка их объема
Фазовый объем, пропорционален фазовой высоте и, соответственно, пропорционален изменению как геометрических изменений клетки, так и изменению ее внутренних свойств, выражающихся в изменении показателя преломления клетки

Определение размеров клеток
Определение площади объектов
Изменение фонового значения приводит к значительным изменениям площади объектов.

Какие характеристики эритроцитов можно измерить с помощью ЛИМ
Площадь фазового изображения эритроцитов – экспериментально измеряемый параметр, достоверное различие площадей эритроцитов может свидетельствовать об изменении характеристик их мембран;
среднее ОРХ клетки – рассчитывалось как среднее арифметическое всех значений ОРХ, входящих в клетку, зависит от толщины клетки и количества вещества (гемоглобина), входящего в эритроцит, произведение площади на среднее значение ОРХ пропорционально содержанию гемоглобина в эритроците;
содержание гемоглобина – расчетная величина, для каждой клетки определяется как произведение среднего ОРХ на площадь эрироцита, а также константы, зависящих от молекулярных характеристик гемоглобина. Содержание гемоглобина оценивалось по формуле:
S- площадь эритроцита, k0- показатель преломления среды (при использовании смеси глицерин вода он составлял 1,40), k0- показатель преломления гемоглобина (принимался равным 1,615), ρHb- удельная плотность гемоглобина, принимается равной 1,36 г/см3;

Заключение
Таким образом, полученные результаты позволяют сделать вывод, что метод ЛИМ является эффективным и мощным средством, позволяющим не только получать изображения клеток с высоким разрешением, но и в ряде случаев количественно оценивать высоту, площадь, объем и содержание вещества в клетках. Полученные данные могут быть использованы для выявления наличия агрегации клеток и точного определения формы клеток. Используя дополнительные методы определения объема можно определять коэффициент преломления (концентрацию вещества) клеток, который может давать дополнительную информацию об изменениях, происходящих в клетке при различных воздействиях на нее

Обработка данных
Обработка изображений
Вычитание фоновой плоскости
Фильтрация случайных помех при помощи различных фильтров
Определение размеров клеток
Статистическая обработка
Описательная статистика
Дескриптивная статистика
И много чего еще

Программы для обработки изображений
FIJI (ImageJ)
Gwiddion
Femtoskan
SPIP
Продукция компании Мекос
Семейство программ Image Pro Plus
Metamorph
И др.

Данная процедура позволяет устранить дефекты, обусловленные следующими причинами
Постоянная составляющая
Постоянный наклон
Искажения, связанные с неравномерностью освещения
Обусловлена наличием:
Жидкости ячейки, обладающей конечной толщиной, заполненной жидкостью с определенным показателем преломления
Обработка изображений
вычитание фоновой плоскости
Обусловлен наличием:
неровностью подложки
неточной установки образца относительно луча света
Процедура позволяет увеличить точность и улучшить детализацию изображений
Удаляется из изображения путем вычитания постоянного наклона.
Для этого находится аппроксимирующая плоскость, которая вычитается из плоскости фазового изображения
Обусловлен наличием:
Неравномерности освещения

Обработка изображений
Фильтрация случайных помех при помощи различных фильтров
Случайные помехи обусловлены следующими причинами
Процедура позволяет увеличить точность изображений
Шумы аппаратуры
Дефекты на матрице
Внешние акустические шумы и вибрации
Устраняется из изображения в результате применения различных фильтров

Определение размеров клеток
Определение границ объектов
Изменение фонового значения приводит к значительным изменениям площади объектов.
Алгоритм водораздела и его варианты

В последние годы требования к статистике при публикации результатов ужесточились, не все российские ученые адаптировались к этим требованиям
К счастью появилось большое количество программ, в которых все считают за вас, даже указывая на применимость или неприменимость метода.
Для исследователя сейчас важно знать терминологию, чтобы нажать правильную кнопку (границы применимости методов тоже – увы, автоматический режим не всегда работает)
Программы, где можно достаточно просто обработать и представить свои данные
(хотя статистические модули есть во всех уважающих себя программах)
GraphPad Prism 7.04, GraphPad Software – проста, есть необходимый минимум и не только, есть подробный хелп по программе и статистике на сайте
Microcal Origin Pro 2018 – мощная программа для представления и обработки данных, есть подробный и понятный хелп
StatSoft, Inc. STATISTICA 10 – программа для статистических расчетов, неплохая подборка материалов о статистике на сайте
MedCalc Statistical Software version 15.8 – неплохая небольшая
программа для статистических расчетов
Статистическая обработка

Статистическая обработка
Как правильно обработать статистические данные?
однозначного ответа нет, зависит от формы проведения эксперимента, количества экспериментальных данных, приборной погрешности и т.д.
Ниже приведены некоторые соображения по обработке статистических результатов применительно к конкретной задаче практикума по микроскопии
Статистическая обработка
Как правильно обработать статистические данные?
однозначного ответа нет, зависит от формы проведения эксперимента, количества экспериментальных данных, приборной погрешности и т.д.
Ниже приведены некоторые соображения по обработке статистических результатов применительно к конкретной задаче практикума по микроскопии
Тем не менее подобный подход применим к обработке любых микроскопических данных

Определение размеров клеток
Да что угодно
Что можно посчитать?
Площадь фазового изображения эритроцитов;
среднее ОРХ клетки;
содержание гемоглобина:
количественные
качественные
порядковые
(оценка их доли)

Статистическая обработка
Схема построения эксперимента
Сравниваем между собой (или с референсными значениями две или несколько проб
Изменение пробы во времени
0
1
2
Количество объектов
Используется нормальное распределение или нет
Распределение объектов по размерам

Описательная (дескриптивная) статистика
Показатели положения экспериментальных данных на числовой оси
наиболее часто встречаемое значение в выборке.
В некоторых случаях может быть две или более мод, что может свидетельствовать о наличии двух (нескольких ) самостоятельных групп.
Среднее арифметическое
показатель центральной тенденции*, полученный делением суммы всех значений данных на число этих данных. Адекватно если у нас нормальное (!) распределение
Медиана
центральное значение признака в последовательном ряду всех полученных значений (половина объектов больше, а половина меньше).
Как вариант: медиана - 50-м перцентиль (0,5-квантиль) или второй квартиль выборки или распределения.
Медиана вместе с квартилями используется для представления дискретных или количественных переменных при ненормальном распределении.
Мода
Максимальное и минимальное значение

Описательная (дескриптивная) статистика
показатели разброса, описывающие степень разброса данных
Стандартное отклонение
Квантили характеризует собой частоту попадания значений переменной в определённые интервалы. Чаще всего используется разделение на 4 интервала (25%, 50%, 75%).
Стандартная ошибка среднего
Доверительный интервал
Квантили, квартили
(интерквартильный размах)
Только для нормального распределения!
Оценивает широту распределения, характеризует разброс данных
Только для нормального распределения!
Характеризует точность нахождения среднего (если ошибка обусловлена случайными причинами)
В биологических исследованиях значения параметра достаточно сильно варьирует, поэтому наиболее оптимальным описанием величины является диапазон, в который укладывается большинство значений исследуемого признака, т.е. ширина распределения.
95% доверительный интервал.
При разделении на четыре квантиля (именуемых квартилями) для предоставления оценки центральной тенденции, ширины и асимметрии распределения результатов достаточно трёх чисел: нижний квартиль (попало 25% самых маленьких значений), 50% квартиль, который соответствует медиане (попало 50% значений), и верхний квартиль (попало 75% самых маленьких значений).
Интерквантильный размах - разность между верхней и нижней квартилью.
из 28

Описательная (дескриптивная) статистика

Описательная (дескриптивная) статистика

Описательная (дескриптивная) статистика
Графическое представление результатов
Гистограмма
Количественные данные
Количественные данные
Качественные данные
Диаграммы
ус
ящик
Нижняя квартиль
Верхняя квартиль
медиана
среднее
Диаграмма размаха
(Ящик с усами)

Статистическая обработка
Оценка достоверности отличий между популяциями
Для этого существуют методы оценки статистической значимости отличий
(дисперсионный анализ)
Принцип построения таких методов
Формулировка 0-вой гипотезы (полученные различия случайны или не случайны)
Определяем вероятность получить наблюдаемые различия при условии справедливости нулевой гипотезы
Есть параметрические (основанные на нормальном распределении – оценке дисперсии) и непараметрические
Т.е. если наша выборка является нормальным распределением – используем параметрические методы, если нет - непараметрические
Наиболее часто используемые критерии
параметрический – парный (двувыборочный) T-тест Стьюдента (с мод.)
Непараметрический – Манна-Уитни U тест
Бывают для зависимых и независимых выборок
Параметрический – Т-тест (для зависимых и независимых выборок)
Непараметрический – Манн-Уитни (для независимых) Вилкоксона (для зависимых)
Если у нас две выборки!

Статистическая обработка
Статистическая обработка измеренного параметра
Находим среднее, стандартное отклонение и стандартную ошибку среднего
Строим гистограмму и корректируем данные (если есть основания)
Определяем нормальное ли у нас распределение
Выбираем критерий и определяем достоверно ли отличаются пробы друг от друга
Здесь не упоминается метрология и основы обработки сигнала
Находим медиану и квартили
да
нет

ПРИМЕРЫ
Нейробластулы (стволовые клетки в культуре)
Тромбоциты человека
Ядерные эритроциты лягушки
Тучные клетки мыши
Эритроциты
Нервное волокно
Визуализация коллоидов
Сравнение с атомно-силовой микроскопией

Нейробластулы (стволовые клетки в культуре)

Тромбоциты человека

Эритроциты лягушки

Гипоосмолярный
Нормоосмолярный
Гиперосмолярный
Сечение
эритроцита
лягушки
Сечение
фазового портрета
Эритроциты лягушки в растворах с различной осмолярностью
Фазовая высота в точке
n1 и n2 показатели преломления раствора и объекта, соответственно, z- толщина образца

Гипоосмолярный
Нормоосмолярный
Гиперосмолярный
Световое изображение
Фазовое изображение
Эритроциты лягушки в растворах с различной осмолярностью

Эритроциты лягушки
Апоптоз эритроцита лягушки

Тучные клетки мыши
Действие ионофора
Изменение во времени
Приводит к выбросу гистамина

ЭРИТРОЦИТЫ

Эритроцит, размещенный на отражающей подложке в физиологическом растворе, является характерным примером измерения прозрачного образца. Содержимое эритроцита представляет собой достаточно однородную массу, поэтому высоту (толщину) рельефа эритроцита, z можно оценивать, используя формулу:
n1 и n2 – показатели преломления среды, напр. плазмы, (1,335) и эритроцита (1,405), соответственно
Параметры эритроцита хорошо изучены, с ним достаточно легко работать, что делает данную клетку удобным модельным объектов для разработки приемов и методик работы с клетками
Кроме этого оценка состояния эритроцитов является диагностическим критерием при оценке ряда патологий

Пример изображения различных форм эритроцитов
Оценка формы

Особенности отображения эритроцитов при помощи ЛИМ
Сечение
Реального объекта
Сечение
фазового портрета
дискоцит
стоматоцит
эхиноцит
0
+1
+2
+3
-3
-2
-1
Оценка формы

Превращения эритроцитов при изменении рН
рН
Фазовое изображение
видео изображение
μ
m
μ
m
20
15
10
5
0
0
5
10
15
20
nm
250
0
μ
m
μ
m
20
15
10
5
0
0
5
10
15
20
nm
250
0
μ
m
μ
m
20
15
10
5
0
0
5
10
15
20
nm
250
0
μ
m
μ
m
20
15
10
5
0
0
5
10
15
20
nm
250
0
4.5
5.5
7.4
8.4
Оценка формы

Превращения эритроцитов при изменении осмолярности
Осмолярность, мОсм
Фазовое изображение
видео изображение
μ
m
μ
m
20
15
10
5
0
0
5
10
15
20
nm
250
0
μ
m
μ
m
20
15
10
5
0
0
5
10
15
20
nm
250
0
μ
m
μ
m
20
15
10
5
0
0
5
10
15
20
nm
250
0
nm
250
0
μ
m
μ
m
20
15
10
5
0
0
5
10
15
20
250
330
500
700
Оценка формы

Определение объема
Определив толщину эритроцитов, z, по формуле:
Можно рассчитать объем клетки (фазовый объем, Vphase), как произведение площади клетки, S, на ее толщину:
или
Таким образом, фазовый объем зависит от площади и показателей преломления среды и эритроцита
Показатель преломления может меняться при изменении состояния эритроцита

Изменение состояния эритроцитов при изменении осмолярности и рН раствора
При нормальной осмолярности и рН значения фазового и геометрического объема совпадают.
При изменении осмолярности наблюдаются значительные различия между величинами этих объемов
Определение объема

Изменение объема клеток приводит к изменению концентрации гемоглобина внутри клетки, что в свою очередь сказывается на показателе преломления эритроцита
Кроме того изменение показателя преломления может быть обусловлена и другими причинами, не связанными с изменением концентрации гемоглобина
(изменение свойств мембраны и гемоглобина)
Определение показателя преломления

Равенство показателей преломления в данном случае позволяет говорить о том что параметр ΦS/V пропорционален концентрации гемоглобина в эритроците
Объемную долю гемоглобина можно пересчитать в объемную концентрацию (г/см3), CV, используя удельную плотность гемоглобина ρHb:
VHb и mHb – объем и масса гемоглобина в эритроците, Величина ρHb, принимается равной 1,36 г/см3
Фазовый объем пропорционален содержанию гемоглобина в эритроците
Определение содержания гемоглобина

Определение содержания гемоглобина
Изменение формы эритроцитов
Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования метода ЛИМ для оценки содержания количества гемоглобина в эритроците и построения распределения содержания количества гемоглобина в популяции

Нервное волокно лягушки

Нервное волокно лягушки
Фазовое изображение участка нервного волокна
Скорость съемки -29.5 фазовых изображений в секунду
Изменение оптической разности хода

Визуализация
коллоидов

Коллоиды серебра в физиологическом растворе

Нейроны прудовика
Нейроны прудовика в физиологическом растворе
Нейроны прудовика в физиологическом растворе + коллоиды серебра
Фазовое изображение
Световое изображение
коллоиды
коллоиды
коллоиды

Эритроциты крысы физиологическом растворе
+ коллоиды серебра
Фазовое изображение
Световое изображение
коллоиды
коллоиды
коллоиды

Сравнение
с атомно-силовой микроскопией

Эритроциты в растворах с различной осмолярностью
безъядерные
АСМ
Гипотонический
Изотонический
Гипертонический
ЛИМ

Эритроциты в растворах с различной осмолярностью
ядерные
АСМ
Гипотонический
Изотонический
Гипертонический
ЛИМ