Лекция 1. Определение предмета Молекулярная биология. Этапы развития. Основные открытия

Молекулярная биология возникла во второй половине XX в.
Название науки чаще всего связывают с именем Уильяма Эстбюри (William Astbury) (1939).
Получил первую рентгенограмму ДНК, впервые выявленную Фридрихом Мишером (1869г.).
Первое официальное упоминание о молекулярной биологии, как новом направлении современной биологии, которое интегрировало усилия биологов, химиков и физиков в области изучения объектов живой природы, принадлежит Уоррен Уиверу, руководившему отделом естественных наук Рокфеллеровского фонда (1938)

Центром молекулярно-биологических исследований стали работы в области изучения материальных основ наследственности, природы генов и механизмов передачи наследственных признаков из поколения в поколение.

Основополагающие открытия молекулярной биологии
1869 – Ф. Мишер впервые выделил ДНК из лейкоцитов и молок лосося.
1935 – А.Н. Белозерский выделил ДНК из растений.
1939 – В.А. Энгельгардт открыл АТФазную активность миозина.
1939 – У. Эстбюри получил первую рентгенограмму ДНК.
1944 – О.Т. Эвери установил, что ДНК (а не белок, как полагали ранее) является носителем генетической информации.
1951 – Л. Полинг и Р. Кори обосновали существование основных типов укладки аминокислотных остатков в полипептидных цепях белков (α-спираль и складчатый β-слой).
1953 – Джеймс Уотсон и Френсис Крик создали модель двойной спирали ДНК на основе рентгенограмм, полученных Розалинд Франклин (Rosalind Franklin) и Морисом Уилкинсом (Maurice Wilkins).
1953 – Фредерик Сенгер расшифровал первичную структуру инсулина быка.

К началу 50х годов XX в. были получены фундаментальные данные об элементарном строении белков, нуклеиновых кислот, включая сведения о способах организации полипептидных цепей белков, и о структуре нуклеотидов и закономерностях их количественного содержания в молекулах ДНК и РНК (Эрвин Чаргафф).
Кроме указанных, биофизические исследования структуры ДНК, выполненные в Англии методом рентгеноструктурного анализа Розалинд Франклин и Морисом Уилкинсом подвели Джеймса Уотсона и Френсиса Крика к раскрытию молекулярной природы генов и механизма их воспроизведения (репликации) в составе ДНК.

1956 – А. Корнберг (Arthur Kornberg) открыл ДНК-полимеразу.
1957 – А.Н. Белозерский и А.С. Спирин предсказали существование мРНК.
1960 – Дж. Кедрью впервые описал трехмерную структуру миоглобина кашалота, а М. Перутц – структуру гемоглобина.
1960 – одновременно в нескольких лабораториях был открыт фермент транскрипции – РНК-полимераза.
1961 – Ф. Жакоб (Francois Jacob) и Ж. Моно (Jacques Monod) разработали модель оперона, установили механизм регуляции генов.
1965-1967 – Р. Холли выяснил первичную структуру аланиновой тРНК, А.А. Баев – валиновой тРНК.
1966 – М. Ниренберг (Marshall Warren Nirenberg), Х.-Г. Корана (Har Gobind Khorana), Р.У. Холли (Robert William Holley) (1968), С. Очоа (Severo Ochoa de Albornoz) расшифровали генетический код.
1967 – М. Геллерт открыл ДНК-лигазу – фермент, способный соединять фрагменты ДНК.
1970 – Г. Темин и Д. Балтимор открыли обратную транскриптазу (РНК-зависимую ДНК-полимеразу) в онкогенных вирусах.
1972 – П. Боэр, С. Коэн и П. Берг разработали технологию клонирования ДНК, заложили основы генетической инженерии.
1972 – Х.-Г. Корана осуществил химический синтез гена аланиновой тРНК.

1975-1977 – Ф. Сенгер, а также А. Максам и У. Гилберт разработали методы быстрого определения первичной структуры ДНК.
1976 – Ф. Сенгер расшифровал нуклеотидную последовательность ДНК фага φХ-174.
1976 – У. Гилберт открыл мозаичное строение генов эукариот.
1976 – С. Ким, А. Рич, А. Клуг определили третичную структуру тРНК.

В середине 60х годов XX в. окончательно утвердился основной постулат молекулярной генетики, формулирующий магистральный путь реализации генетической информации в клетке:
ДНК → РНК → Белок
Изучались механизмы воспроизведения (репликации) ДНК, транскрипции (биосинтеза РНК) и трансляции (биосинтеза белка).
Постулат дополнен представлениями о существовании процесса обратной транскрипции (о биосинтезе ДНК на матрице РНК) и репликации РНК:

«Молекулярная биология изучает связь структуры биологических макромолекул и основных клеточных компонентов с их функцией, а также основные принципы и механизмы саморегуляции клеток, которые опосредуют согласованность и единство всех протекающих в клетке процессов, составляющих сущность жизни»
(Дж. Уотсон, 1968 г.).

Детализировались представления о строении и функциях белков, необходимых для
катализа (ферменты) и
регуляции (регуляторные белки, пептидные гормоны) важнейших молекулярно-генетических процессов.

В конце 70-х, начале 80х годов XX в. выясняются механизмы сплайсинга (В. Келлер и др.),
происходит открытие РНК-ферментов (рибозимов) и аутосплайсинга (Т. Чек),
исследуются механизмы генетической рекомбинации и подвижные генетические элементы (Д. Хогнесс, Г.П. Георгиев),
ведутся работы в области исследования структуры ферментов и биологических мембран (Ю.А. Овчинников),
начинаются работы по расшифровке структуры геномов высших организмов (включая геном человека),
создаются основы новых (генно-инженерных) биотехнологий,
обнаруживаются и синтезируются каталитически активные антитела (абзимы),
возникает белковая инженерия.

Взаимосвязь молекулярной биологии с науками, составляющими современную физико-химическую биологию

Развитие молекулярной биологии привело к возникновению в начале 80х годов XX в. новой науки – биоинформатики (вычислительной биологии, компьютерной генетики), возникшей на стыке молекулярной генетики и информатики.
Связано с появлением быстрых методов определения нуклеотидных последовательностей ДНК, разработанных в 1975-1976 гг. Ф. Сенгером и А. Коулсоном, а также А. Максамом и У. Гилбертом.
В 1982 г. были организованы банки нуклеотидных последовательностей: Gen Bank в США и EMBL в Европе, в которых концентрировалась информация о расшифрованных нуклеотидных последовательностях ДНК различных организмов.

Биоинформатика решает ряд важных молекулярно-биологических проблем:
Статистический анализ нуклеотидных последовательностей ДНК;
Предсказание функций по первичной структуре биополимеров (ДНК, РНК, белков);
Анализ (моделирование) пространственной структуры белков и нуклеиновых кислот;
Теория молекулярной эволюции и систематики.

Прогресс в области определения нуклеотидных последовательностей (секвенирования) ДНК различных организмов
Секвенирован первый бактериальный геном (1995);
Геном дрожжей (1997);
Геном нематоды (1998);
Геном дрозофилы и почти полностью геном человека (2000)
Привел к возникновению геномики – науки, изучающей наборы всех генов данного организма как единое целое.
Одновременно возникла протеомика – наука, исследующая полные наборы белков, функционирующих на различных этапах развития организма.

Задачи молекулярной биологии:
Расшифровка структуры геномов;
Создание банков генов;
Геномная дактилоскопия;
Изучение молекулярных основ эволюции, дифференцировки, биоразнообразия, развития и старения, канцерогенеза, иммунитета и др;
Создание методов диагностики и лечения генетических болезней, вирусных заболеваний;
Создание новых биотехнологий производства пищевых продуктов и разнообразных билогически активных соединений (гормонов, антигормонов, релизинг-факторов, энергоносителей и др.).

Методы молекулярной биологии
1. Микроскопия – световая, электронная, сканирующая электронная микроскопия
Электронная микроскопия позволяет обычно различать объекты размером около 2 нм (предел разрешения до 0,1 нм) – имеет широкое применение для изучения структур вирусов, внутриклеточных органелл, белково-нуклеиновых комплексов (хроматин, рибосомы) и отдельных белковых молекул.
В том числе криоэлектронная микроскопия, сканирующая электронная микроскопия.
Рисунок. Растровый электронный микроскоп Quanta 200 (FEI Company, США)

2. Рентгеноструктурный анализ – основан на дифракции рентгеновских лучей (электромагнитного излучения с длиной волны около 10-10 м); позволяет выявить трехмерное расположение атомов в молекулах (разрешение составляет менее 0,1 нм).

3. Радиоактивные изотопы – широко используются для изучения нуклеиновых кислот, белков, углеводов и других молекул в живой клетке.
Радиоизотопы нестабильны и подвергаются спонтанному распаду, при котором либо высвобождаются заряженные частицы – электроны, либо происходит гамма-излучение. Период полураспада варьирует от короткого, например, у изотопа 32Р (14 сут), до очень протяженного, у 14С (5570 лет).
Электроны определяют по ионизации газа в сцинцилляционном счетчике Гейгера, либо методом радиоавтографии (по их воздействию на серебро, содержащееся в чувствительном фотоэмульсионном слое).

4. Ультрацентрифугирование – (седиментационный анализ). Широкое распространение получило после 1926 г. (изобретение аналитической ультрацентрифуги Т. Сведбергом, с помощью которой впервые им была определена молекулярная масса гемоглобина).
Скорость седиментации (осаждения) определяется размером и формой разделяемых компонентов и выражается коэффициентом седиментации S.
Коэффициент седиментации измеряется в секундах, однако коэффициенты седиментации обычно представляют собой очень малые значения и поэтому выражаются в единицах Сведберга (S): 1S = 1· 10-13.
Н., коэффициент седиментации молекулы гемоглобина составляет 4,5 S, молекулы тРНК – 4S, рибосомы кишечной палочки – 70S, лизосомы – 9400S.

В 40-50-е годы XX в. А.Клод и Ж.Браше разработали метод дифференциального центрифугирования для разделения органелл клетки, с помощью которого де Дюв впервые выделил лизосомы (1953), а затем пероксисомы.
1957 – М. Месельсон, У. Сталь, Дж. Виноград разработали метод центрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия для разделения нуклеиновых кислот, с помощью которого было установлено, что репликация ДНК осуществляется полуконсервативным путем.

5. Методы фракционирования белков
А. Хроматография – ионообменная, гель-хроматография, аффинная хроматография (хроматография по сродству), высокоэффективная жидкостная хроматография.
Б. Электрофорез – в основе метода лежит способность белков, обладающих определенным суммарным положительным или отрицательным зарядом, перемещаться в электрическом поле в соответствии с величиной заряда, размером и формой молекул.

6. Культура клеток – метод берет начало с 1885 г.
(Вильгельм Ру)
В настоящее время используют диссоциированные культуры клеток, из которых можно получить клетки одного типа.
Клеточные линии служат источником большого количества клеток одного типа, могут храниться при ⁓-70°С неопределенно долго, не теряя способности в пролиферации.
Наиболее часто используются клеточные линии фибробластов мышей и хомячков, а также эпителиальные клетки человека.