Лекция 11. Пыльцевая трубка. Основные механизмы полярного роста

Скорость роста – до 1 см/час!
Длина – до десятков сантиметров!
Безошибочная «адресная» доставка спермиев через ткани пестика
Хранение без потери способности к прорастанию в течение десятков лет!
И все эти возможности заключены в зернышке диаметром около 0,03 мм!
Огромные возможности
маленького организма

1824
1847
Ассирийские священники и египетские боги изображались в процессе ритуального опыления пальмы (5000 лет до н.э.).
Уже тогда было известно, что для гарантированного получения семян требуется переносить пыльцу на рыльце
Однако точное установление роли пыльцевой трубки в доставке «мужской компоненты» - только в середине XIX века
Пыльца с нами
тысячи лет

Что представляет собой пыльца? Мужской гаметофит – гаплоидное поколение семенных растений, у цветковых - организм из 2х или 3х клеток

Жизнь пыльцы

Пыльцевая трубка как модельный объект
Гаплоидный геном – легко выявить важные гены
Отсутствие межклеточных контактов – напрямую реагирует на внешние воздействия
Малый размер и состояние покоя – удобно хранить и культивировать
Сходство с другими объектами, характеризующимися полярным типом роста
Высокая скорость роста (у цветковых)

Ключевые механизмы поддержания полярного роста:
Зональная организация цитоплазмы позволяет каждой органелле быть «в нужное время в нужном месте»
Неоднородность в строении клеточной стенки позволяет тургору растягивать клетку направленно
Каллозные пробки и вакуоли позволяют не наращивать объем цитоплазмы бесконечно
На молекулярном уровне: сигнальные сети контролируют процесс через цитоскелет и поляризованную секрецию
Как пыльцевой трубке удается так быстро расти?

Везикулярный транспорт и движение органелл по цитоскелету: доставка стройматериалов и энергообеспечение
Клеточная стенка – механическая составляющая
Ионные градиенты и мембранный потенциал
ГТФазы и другие компоненты сигнальных каскадов (активно изучаются)
АФК (малоизучено)
Основные игроки

Апикальный (или «растущий») компартмент
Базальный компартмент
Апикальный рост пыльцевой трубки поддерживается за счет полярной организации цитоплазмы. Она разделена на функциональные компартменты:
Полярность структуры

Функции циклоза
1. Транспорт мужского гаметного модуля (MGU).
2. Транспорт в апекс сигнальных молекул и ферментов для взаимодействия с пестиком.
3. Строительные материалы, включая фосфолипиды, полисахариды, стеночные ферменты.
4. В апексе везикулы доставляются в определенные зоны поверхности, где происходит их экзоцитоз.
5. Эндоцитоз обеспечивает приток в трубку из пестика питательных веществ и сигнальных молекул, поддерживает «уникальность апекса» и правильное соотношение между материалами для строительства стенки и плазмалеммы.

Растущий компартмент
Lancelle, Hepler, 1992
Брейгина и др., 2009

Цитоскелет

Актиновый цитоскелет играет ключевую роль в поддержании полярного роста
Продольные актиновые тяжи обеспечивают ток цитоплазмы (фонтан)
Кольцевая структура в субапикальной зоне задает направление роста. Скорее всего, путем регуляции везикулярного транспорта
Виллин стабилизирует филаменты актина там, где концентрация кальция низкая
Профилин не дает тяжам сформироваться в апикальной зоне, где концентрация кальция на порядок выше.
Кофилин и Actin depolymerizing factor (ADF) регулируются рН, их активность определяется рН профилем
Микрофиламенты
Cheung et al., 2008
Lovy-Wheeler et al., 2005

Микротрубочки
Отвечает за транспорт спермиев к зародышевому мешку
Остальные функции неизвестны
Ингибиторы не останавливают рост ПТ
Кинезин идентифицирован
Часто располагается вместе с МФ, а также образует комплексы с ПМ и ЭПР
Lancelle et al., 1987
Laitiainen et al., 2002

Рециклирование мембран необходимо для поддержания полярности – «уникальность апекса».
В пыльцевой трубке образование окаймленных пузырьков с клатриновой шубой происходит в субапикальной области
Дальнейшее движение везикул происходит по актиновым филаментам «ошейника»
Контроль за эндоцитозом осуществляет фосфатидил-инозитольная сигнальная система.
Эндоцитоз
Bove et al., 2008

Поляризованная секреция поддерживается благодаря актиновому цитоскелету, а также аннексину и белкам экзоцистного комплекса
Экзоцисты предсталяют из себя октомерный комплекс из белков, отвечающих за движение пузырька вдоль цитоскелета, а также определяющих место его слияния с ПМ.
Аннексины отвечают за слияние мембран. Их активность зависит от концентрации кальция
Большинство ученых считают, что экзоцитоз происходит в самом кончике, однако есть и другая гипотеза.
Экзоцитоз
Breygina et al., 2012
Kroh, Knuiman, 1985

Клеточная стенка:
градиент жесткости
Движущей силой для роста является тургорное давление. Однако, оно не является векторной силой. За счет чего же рост становится направленным?
Механический градиент жесткости
Какие компоненты ответственны за него?
Chebli, Geitmann, 2007

Этерифицированные пектины откладываются в кончике трубки в процессе экзоцитоза
По мере удаления от кончика они деэтерифицируются при участии фермента пектинметилэстеразы (ПМЕ)
Кальций участвует в образовании сшивок между молекулами пектинов, увеличивая прочность полимерной сети
Это обеспечивает градиент жесткости от кончика к ПЗ
Пектины
Кислые пектины
Метилированные пектины
Li et al., 1994
Parre, Geitmann, 2005

Каллоза
Breygina et al., 2012
Xie et al., 2012
Отсутствует в кончике
Появляется на расстоянии 10-30 мкм
Образует каллозные пробки в длинных трубках
Откладывается в кончике в ответ на
стрессовое воздействие

Жесткий компонент, но его не очень много
Отложение также неравномерное: в кончике отсутствует, далее постепенно накапливается по направлению к ПЗ.
У голосеменных присутствует в кончике – медленный рост
Целлюлоза
Parre, Geitmann, 2005

Регуляторные механизмы: кальций
Hepler, 2012
Кальций входит в кончике трубки через каналы , а в субапикальной области входит в органеллы и выкачивается через ПМ с помощью помпы.
Таким образом, поддерживается крутой градиент его концентрации в апикальной зоне
Кальций – центральный регулятор роста, с нарушением градиента рост прекращается
Michard et al., 2008

Кальциевый градиент определяет место слияния везикул с ПМ и, таким образом, задает направление роста
Кальций регулирует динамику актиновых филаментов через Са-чувствительные актин-связывающие белки (ABPs),
Кальций модулирует активность Са-зависимых протеин-киназ (CDPKs)
Регуляторные механизмы: кальций
Michard et al., 2008

В кончике рН кислый, протоны входят в цитоплазму, предположительно, через неспецифичные катионные каналы. Кислый кончик присутствует только в растущих трубках.
В субапикальной зоне обнаружен «щелочной поясок», именно в этой зоне работают Н+-АТФазы, выкачивающие протоны. Присутствует даже в нерастущих трубках.
Протонный градиент
Chebli, Geitmann, 2007
Michard et al., 2008
Podolyan et al., 2019

контроль
ортованадат
фузикокцин
Брейгина и др., 2010
Градиент мембранного потенциала
контроль
ортованадат
NPPB
Брейгина и др., 2010

Таким образом, пыльцевая трубка – прекрасная модель для изучения ИОННОЙ РЕГУЛЯЦИИ РОСТА, которая включает в себя
Работу ионных каналов и помп
Их дифференциальную регуляцию
Градиенты концентрации ионов в цитоплазме
Электрическое поле и мембранный потенциал
Ионная регуляция
Michard E. et al. 2009. Int. J. Dev. Biol. 53: 1609-1622; Gutermuth T. et al., 2013. Plant Cell. 25: 4525.

Регуляторные механизмы: ГТФазы
Qin, Yang, 2011
GFP-NtRab2
Маленькие ГТФ-связывающие белки - универсальные переключатели сигнальных путей.
Rab2 осуществляет контроль секреторного пути между ЭПР и аппаратом Гольджи в растущей пыльцевой трубке, локализован в аппарате Гольджи.
Rab11b локализован в везикулах и отвечает за терминальный участок секреторного пути: слияние везикул с плазмалеммой
ROP1 локализован в апикальной ПМ и важен для поддержания локального экзоцитоза.

Фосфатидилинозитолдифосфат (PIP2) есть только в апикальной мембране растущих ПТ
Его узкая локализация обеспечивается белком phosphotidylinositol transfer protein (PITP) и фосфолипазой C (PLC), которая режет PIP2 с образованием инозитол-3-фосфата (IP3) и диацилглицерола (DAG)
Этот процесс необходим для поддержания ионных градиентов и полярной структуры актиновых тяжей (через регуляцию актин-связывающих белков).
Регуляторные механизмы: фосфолипиды
Helling et al., 2006

Осцилляции
Chebli, Geitmann, 2007

Никита Максимов, к.б.н.
Саша Подолян, аспирант 1 года
Группа репродуктивной физиологии растений МГУ
Группа в контакте: http://vk.com/club83308044
Е.С. Клименко, нс

АФК как сигнал от «принимающей стороны»
АФК накапливаются в тканях рыльца различных видов при подготовке к опылению.
АФК входят в состав рыльцевого экссудата
1. Рыльце

Проточная цитометрия: как?
a
b
c
Что такое облако протопластов?!
Данные получены в сотрудничестве с Е.Шиловым

Экссудат рыльца и экзогенный Н2О2 вызывают гиперполяризацию мембраны пыльцевых протопластов
Эффект экссудата снимается каталазой и тушителем MnTMPP
Основное действующее на МП вещество экссудата - Н2О2
АФК как сигнал от «принимающей стороны»
Данные получены в сотрудничестве с Е.Шиловым
АФК как сигнал от «принимающей стороны»

АФК как сигнал: H2O2 активирует Ca2+ ток и вход Ca2+ в цитоплазму
Breygina et al., 2016. Plant Biol.18: 761-67.
H2O2 индуцирует вход Ca2+ в цитоплазму (краситель Fluo-3) в протопластах табака и трубках лилии
10 µМ H2O2
10 µМ H2O2+ нифедипин
H2O2 активирует входящий Ca2+ ток в протопластах лилии
Podolyan et al., 2019

АФК как сигнал: H2O2 активирует ток K+
Сравнение средней плотности тока при (в % от контроля).
H2O2 – активирует K+ ток; TEA – ингибитор K+ каналов, блокирует ток.
Средние вольт-амперные характеристики выходного K+ тока.
Breygina et al., 2016

АФК как сигнал: H2O2 убирает в трубках «щелочной поясок»
В растущих трубках лилии вслед за массированным входом кальция происходит сглаживание градиента рН, что указывает на ингибирование Н+-АТФазы
контроль
H2O2
Podolyan et al., 2019

Два оптических метода оценки Em
Ратиометрический быстрый краситель Di-4-ANEPPS:
Съемка в двух каналах при возбуждении синим (Fb) и зелёным (Fg) светом – нет зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации красителя;
Не выцветает и быстро реагирует на изменения – позволяет регистрировать динамику.
Медленный краситель DiBAC4(3):
позволяет определить абсолютные значения Em (расчет ведется относительно полностью деполяризованных клеток)
Прост в использовании: позволяет работать с большими популяциями клеток, набирая статистические данные.

Количественная флуоресцентная микроскопия: динамика эффекта
Проточная цитометрия с красителем DiBAC4(3): исследование большой популяции протопластов
АФК как сигнал: H2O2 вызывает гиперполяризацию
Максимов и др., 2015. Цитология, 57: 720-26.
Fb
Fg
контроль
10 µМ H2O2
Данные получены в сотрудничестве с Е.Шиловым
Максимов и др., 2015

Гиперполяризация плазмалеммы при действии H2O2 (10 μМ) - распределение
После 10 минут инкубации происходит достоверное смещение популяции в область более отрицательного потенциала.

АФК как сигнал: H2O2 вызывает гиперполяризацию
Количественная флуоресцентная микроскопия с красителем di-4-ANEPPS: растущие трубки лилии
контроль
500 µM
H2O2
Podolyan et al., 2019

Ca2+
K+
АДФ + Фн
АТФ
H+
Cl-
H2O2
+
+
?
?
Em

В трубке ион-транспортные системы расположены полярно
Они формируют в цитоплазме динамичные градиенты концентраций, а на мембране – градиент МП
АФК-сигнал, приходя в трубку, меняет прямо или косвенно работу практически всех ион-транспортных систем
Тем самым АФК вызывают перестройку внутренних градиентов
NOX
H2O2
АФК как сигнал: H2O2 вызывают перестройку всех градиентов

Пероксид водорода вызывает изменения протеома пыльцы. Появляются более 50 белков, которых не было в контроле.
Основные направления: энергетика, метаболизм, синтез белка
Всё для активного роста!
Ни одного антиоксиданта!
АФК как сигнал: протеомика
Данные получены в лабораторией протеомики ИБХ РАН

Цветковые VS Хвойные
Изученный модельный объект
Быстрый рост
Униполярный рост
Обращенный фонтан
Крутой градиент Са2+
Крутой градиент МП
Зависимость от межклеточного взаимодействия
Относительно новый объект
Медленный рост
Возможность биполярного роста
Прямой фонтан
Плавный градиент Са2+
Плавный градиент МП
Больше «автономности»
Цветковые
Хвойные

Градиент мембранного потенциала
табак
ель

Биполярное прорастание у ели
Breygina et al., 2019
(в соавторстве с Полевовой С.В.)

Две трубки, а МГМ один. Куда же он пойдет?
Он тоже сомневается…
b
a
c
d
Биполярное прорастание: ядро
Breygina et al., 2019

Биполярное прорастание: динамика
2 часа
6 часов
9 часов
Сколько разрывов – столько и трубок
Breygina et al., 2019

Биполярное прорастание характерно для мешковой пыльцы
Мы описали феномен и посмотрели, можно ли на него повлиять
Снова АФК!
Биполярное прорастание: почему?
Breygina et al., 2019

Никита Максимов, к.б.н.
Саша Подолян, аспирант 1 года
Группа репродуктивной физиологии растений МГУ
Группа в контакте: http://vk.com/club83308044
Е.С. Клименко, нс