Магнитные изотопные эффекты (миэ) в металл-зависимом ферментативном катализе и их роль в фармакологии. Нанокатиониты

Магнитный изотопный эффект
выражается в зависимости скорости химической реакции (или вероятности рождения молекулы)
от ядерного спина,
его проекции,
магнитного момента и
энергии электро-ядерного (сверхтонкого Кулоновского) взаимодействия.
Step E.N.// Chem. Phys. Lett. 1991. 186. P. 405.

Распространенность изотопов
биологически активных двухвалентных металлов в природе

Нанотопология активного сайта креатинкиназы
Комбинированное решение уравнений Шредингера и Пуассона
Влияние нанотопологии каталитического сайта КК на перекрывание электронных плотностей реагентов
7-10нм
Mg2+

Скорость образования АТФ митохондрией (А)
и креатинкиназой (В) как функция изотопа Mg
ИНТАКТНАЯ МИТОХОНДРИЯ
МИТОХОНДРИЯ, ПОДВЕРГНУТАЯ СЕЛЕКТИВНОЙ БЛОКАДЕ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ С ПОМОЩЬЮ 1-МЕТИЛНИКОТИНАМИДА
Выход АТФ в ммоль/г общего белка

Формирование ион-радикальных пар
(Синглет-триплетный каналы фосфорилирования)
Магнитный изотопный эффект 25Mg2+ в регуляции митохондриального синтеза АТФ, осуществляемого креатинкиназой

Ион-радикальный механизм глицерофосфаткиназной реакции

Схема реакции фосфорилирования с помощью АТФ синтазы

НАНОКАТИОНИТЫ
Способны переносить катионы металлов и «отдавать» их в условиях избытка положительных зарядов в окружающей среде (метаболический ацидоз)

Структура PMC-16
(Пат. ЕР 1992627А1, 2007)

ПЕЧЕНЬ
МИТОХОНДРИЯ
ЦИТОПЛАЗМА
ПЛАЗМОЛЕММА
ЯДРО
Время, ч
(имп/мин[59Fe]PMC16 ) / мг белка) х 10-3

Время, ч
МИТОХОНДРИЯ
ЦИТОПЛАЗМА
ПЛАЗМОЛЕММА
ЯДРО
МИОКАРД
(имп/мин[59Fe]PMC16 ) / мг белка) х 10-3

ФАРМАКОКИНЕТИКА [Mg]PMC16 (КРЫСЫ)
Однократная внутривенная инъекция 20мг/кг
(M ± SEM, n = 6)
мониторинг в течение 24 ч

КАТАЛИТИЧЕСКИЙ САЙТ ФЕРМЕНТА
ДОКИНГ РМС16

МИКРОФОТОГРАФИИ ПЕРИНУКЛЕАРНОЙ ОБЛАСТИ МИОКАРДИОЦИТОВ КРЫСЫ
(ПРОСВЕЧИВАЮЩАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ)

ДИСПЛАЗИЯ МИТОХОНДРИЙ МИОКАРДИОЦИТОВ КРОЛИКА
(ИНДУЦИРОВАНА ДОКСОРУБИЦИНОМ)
(B) Митохондрия (M):
0.2 DL50 PMC16, 6 часов →
0.5 DL50 DXR, 12 часов
Гранулярная
деструкция
матрикса
A
B
Митохондрия (M):
0.5 DL50 DXR, 12 часов
25Mg2+

A
B
25Mg2+
ДИСПЛАЗИЯ ЯДРА МИОКАРДИОЦИТОВ КРОЛИКА
(ИНДУЦИРОВАНА ДОКСОРУБИЦИНОМ)
25Mg2+
Гранулярная
деструкция
матрикса
Ядро (N):
0.5 DL50 DXR, 12 часов
(B) Ядро (N):
0.2 DL50 PMC16, 6 часов →
0.5 DL50 DXR, 12 часов

Перспективы применения в нейробиологии «умных» нанокатионитов на основе
порфириновых аддуктов фуллерена С60
Магнитные изотопные эффекты в биологии. Концепция спин-селективной биохимии (Академик РАН А.Л. Бучаченко)
Применение: профилактика и терапия острой и хронической ишемии головного мозга
(Порфириновые рецепторы в большом количестве содержатся в митохондриях нейронов).

ВОЗМОЖНЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ [Mg]PMC16, ПРЕДСКАЗАННЫЕ НА ОСНОВЕ ИХ СТРУКТУРЫ

Магнитный изотопный эффект 43Ca
Y, [(нмоль АТФ/мин)/мг КК]х10-3
A, [имп/мин γ-[32P]АТФ/мг КК]х10-3

Zn-индуцированный синтез АТФ креатинкиназой

Zn-индуцированный синтез АТФ пируваткиназой

Синтез ATP креатинкиназой зависит
от изотопии Ca и Zn • с немагнитными изотопами 40Ca (1) и 64Zn
• с магнитными изотопами 43Ca (2) и 67Zn

Уровень предельных величин замещения магния экзогенными ионами Ca2+ и Zn2+
в молекулах креатинкиназы и ДНК-полимеразы β
ДНКпβ – ДНК-полимераза β
Содержание Me2+ в
молекулах фермента,
пг/мг белка

Предпосылки применения МИЭ
МИЭ в управлении
металл – зависимым
ферментативным катализом
(А.Л. Бучаченко и соавт., 2005-2013;
Sarkar et al., 2007-2011; Amirshahi et al. 2008-2011)
ДНК-полимеразы β :
легитимные мишени для действия цитостатиков
(М.А. Орлова и С.А. Румянцев 2012-2013;
А.Л. Бучаченко и соавт., 2013)
Фармакологическое
применение
МИЭ-43Ca2+

1 – маркер, кислый гликопротеин плазматической мембраны клеток HeLa,
2 – маркер, гистон Н1А клеток HeLa,
3 - бета – подобная ДНК-полимераза из хроматина ядер клеток HL-60,
4, 6, 7 – суммарный белок хроматина ядер миелоцитов/промиелоцитов/миелобластов здоровых доноров,
5 – суммарный белок ядер клеток HL-60,
8, 9 – суммарный белок хроматина ядер клеток HL-60,
10 – суммарный белок нуклеоплазмы ядер клеток HL-60.
Изоэлектрическое фокусирование
продуктов фракционирования ядер клеток HL-60 и миелоцитов/миелобластов здоровых доноров

Очистка и характеристика
ДНК-полимеразы β
из частично фракционированного хроматина клеток HL-60
А и Б - ИЭФ очищенной бета–подобной ДНК-полимеразы и коммерческих маркеров.
В - SDS – PAGE анализ: 1 – коммерческие маркеры, 2 – 5 – очищенный фермент (5,0, 1,0, 0,5 и 0,1 мкг/гель).
Г - Электрофорез ДНК в агарозном геле:
1, 3 – коммерческие маркеры однотяжевой ДНК, 2 – фрагменты ДНК, процессированные выделенной ДНК-полимеразой.
Профиль разделения белков хроматина из клеток HL-60 на колонке TOYOPEARL HW 55F и
каталитической активности
выделенной бета-подобной ДНК-полимеразы
А
Б
В
Г

Идентификационные критерии
ДНК-полимераз семейства β
Молекулярная масса <110 кДа
Низкая процессивность фермента
Низкая продуктивность (n<300)
Mg-зависимый фермент
Мономер
Отсутствие 3’,5’-экзонуклеазной активности
Локализация в хроматине
Резистентность к таким ингибиторам, как Афидиколин
и N-этил-меламид
ИЭТ 8.2 - 8.6
Активация фермента при высоких концентрациях KCl (200mM)

Каталитическая активность бета-подобной ДНК-полимеразы,
выделенной из хроматина клеток HL-60:
воздействие ингибиторов и KCl

Зависимость скорости синтеза ДНК ДНК-полимеразой β из клеток HL-60
от концентраций ионов 40Ca2+ и 43Ca2+
A – (имп/мин [H3]ДНК)/мг фермента
А х 10-3

Механизм
нарушения
синтеза ДНК
путь

В отличии от киназ, в случае ДНК-полимераз донором электрона выступает кислород рибозы, а не фосфатной группы.
Под воздействием магнитного момента ядра изотопа 43Ca2+, находящегося в каталитическом сайте фермента, образуется ион-радикальная пара.
Существуют 3 возможных варианта разрыва связи после присоединения нуклеотида к растущей цепи ДНК, лишь один из которых (-) приводит к удлинению праймера.
В случае ион-радикальной пары этот путь подавляется, что и приводит к уменьшению активности ДНК-полимеразы.
Дифосфатная группа удаляется при участии второго иона Mg2+
Присоединение нуклеотида к растущей цепи ДНК
гидролиз
гидролиз
праймер
МЕХАНИЗМ РЕАКЦИИ ДНК-полимеризации

Влияние МИЭ - Ме2+ на кинетику катализа, обеспечиваемого ДНК-полимеразой β из клеток HL-60 ([Ме2+]opt=20 mM)
*Mg *Ca 25Mg 43Ca
*Mg *Ca 25Mg 43Ca
KM, mM (M±m, n=6)
Kcat, (µM dTTP)/мин)/мг белка(M±m, n=6)

Условия инкубации фермента оптимизированы:
рН 8.0, + 37 °С, 20 мМ MeCl2, 60 мин
ВОЗДЕЙСТВИЕ ИЗОТОПИИ ИНКУБАЦИОННОЙ СМЕСИ
ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ β
НА ДЛИНУ СИНТЕЗИРОВАННЫХ ФРАГМЕНТОВ ДНК
1 – ДНК-маркеры, 110 – 489 n;
2 - 2-20 мМ 43CaCl2, без Mg;
3 - 3-20 мМ 25MgCl2, без Ca;
4 - 4-20 мМ 40CaCl2, без Mg;
5 - 5-20 мМ 24MgCl2, без Ca;
Электрофорез в 2.0%-м геле агарозы

n
n
n
Относительная активность ДНК-полимеразы β
Изменение каталитической активности ДНК-полимеразы β
как проявление МИЭ 43Ca2+

ЗАВИСИМОСТЬ
ОТНОСИТЕЛЬНОЙ КАТАЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
И
ПРОДУКТИВНОСТИ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ β
ОТ
ВЕЛИЧИНЫ ЗАМЕЩЕНИЯ МАГНИЯ ИЗОТОПАМИ КАЛЬЦИЯ ВО ВНУТРИФЕРМЕНТНОМ ПУЛЕ ДВУХВАЛЕНТНОГО МЕТАЛЛА

Влияние наночастиц PMC16, транспортирующих изотопы Mg и Ca,
на выживаемость клеток (LC50) HL-60 и
миелобластов здоровых доноров (p<0,01)

МАКСИМАЛЬНО ДОСТИЖИМЫЙ УРОВЕНЬ
ЗАМЕЩЕНИЯ ЭНДОГЕННОГО Mg2+ КАЛЬЦИЕМ
В ОЧИЩЕННОЙ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЕ БЕТА ИЗ КЛЕТОК HL-60
A – Контроль
(нативный фермент);
Б – Эксперимент
(Mg – Ca замещение)
20 mM CaCl2/
15 mM Трис-HCl (pH 8.0) /
1.5 mM ЭДТА/
+37°C/
2ч

Кривые доза-эффект
препаратов порфирин-фуллеренов (Ме4[PMC16])
для клеток линии HL60 (миелобластный лейкоз)
Цитотоксический эффект магнитных изотопов проявляется во всех исследованных концентрациях, начиная с минимальных. Это может говорить о высоком потенциальном противоопухолевом эффекте, однако требуются дополнительные эксперименты, направленные на выявление потенциальных механизмов действия, механизмов гибели клетки, взаимодействия с традиционными химиопрепаратами (возможно как усиление их действия, так и цитопротекторный эффект, в первую очередь в отношении здоровых клеток.
Наиболее классическая кривая дозо-зависимого эффекта в отношении бластных клеток отмечается у немагнитных изотопов магния и кальция, что совпадает с результатами более ранних экспериментов на клетках пациентов с ОЛЛ.

Распределение опухолевых клеток,
окрашенных Аннексином-V/FITC и PI по флуоресценции
после инкубации без PMC16(25Mg) (а) и с PMC16(25Mg) (б)

Результаты оценки индукции апоптоза
Распределение опухолевых клеток, окрашенных Annexin V/FITC/PI по флуоресценции
после инкубации без препарата (а) и с препаратом (б)

Сравнение LС50 препаратов PMC16(Co), PMC16(24Mg), PMC16(25Mg), p<0,01.
LC50, мг/мл

Медианы LС50 препаратов
LC50, мг/мл
LC50, мг/мл
LC50, мг/мл
LC50
LC50

PMC16
25Mg2+,43Ca2+
PMC16
PMC16
25Mg2+,43Ca2+
25Mg2+, 43Ca2+
КК, αФГК, ПК, АТФ-синтаза
∆[дНТФ]↑
Поддержка Анаболизма
Перинуклеальные Пермеазы
25Mg2+, 43Ca2+
Пересыщение
ядерного пула дНТФ
ДНК-полимераза бета
Некорректная Репарация ДНК
ЯДРО
ЦИТОПЛАЗМА
ВНЕКЛЕТОЧНАЯ СРЕДА
КОНЦЕПЦИЯ ЦИТОСТАТИЧЕСКОГО ПОТЕНЦИАЛА МИЭ – Me2+
(А. Л. БУЧАЧЕНКО и соавт., 2006 – 2014)
Синергизм цитоплазматических и внутриядерных событий,
конвертирующих МИЭ 25Mg и 43Ca в цитостатическое воздействие на клетку опухоли