Молекулярно-генетический уровень жизни. Матричные процессы

Реализация генетической информации: матричные процессы

Экспрессия гена
процесс, в ходе которого наследственная информацияпроцесс, в ходе которого наследственная информация от гена преобразуется в функциональный продукт — РНКпроцесс, в ходе которого наследственная информация от гена преобразуется в функциональный продукт — РНК или белок
Этапы экспрессии генов:
транскрипция,
процессинг РНК,
трансляция,
посттрансляционная модификация белков

Основные отличия организации генов прокариот и эукариот

регуляторная область: рядом со структурными генами – промотор и оператор; на некотором расстоянии от оперона – активаторы и ингибиторы
кодирующая часть: структурные гены – обычно в одном опероне несколько структурных генов, которые отвечают за полную реализацию процесса
Организация генов прокариот - оперон

Организация генов прокариот оперон
промотор – регуляторная последовательность, узнаваемая ферментом РНК-полимеразой
оператор – регуляторная последовательность, связывающаяся с белком-репрессором, выключающим процесс транскрипции
терминатор – нуклеотидная последовательность ДНК, на которой завершается транскрипция гена или оперона
спейсер (от англ. spacer – «разделитель») – участки нетранскрибируемой ДНК, расположенные между тандемно повторяющимися генами

энхансер (англ. enhancer – усилитель, увеличитель) – небольшой участок ДНК, который после связывания с ним факторов транскрипции стимулирует транскрипцию с основных промоторов гена или группы генов.
Энхансеры не обязательно находятся в непосредственной близости от генов, активность которых они регулируют.
Молекулярный механизм действия энхансера заключается в том, что он благодаря собранному на нём белковому комплексу привлекает РНК-полимеразу и кофакторы транскрипции в область промотора
Организация генов прокариот оперон

Организация генов прокариот промотор

более сложное строение регуляторного участка
один структурный ген
интронно-экзонная организация структурного гена
сайленсеры – последовательность ДНК, с которой связываются белки-репрессоры (факторы транскрипции). Связывание белков-репрессоров с сайленсерами приводит к понижению или к полному подавлению синтеза РНК
Организация генов эукариот - транскриптон

Организация генов эукариот - транскриптон

Транскрипция ДНК
* Перенос информации на РНК
Транскрибируется:
короткий участок ДНК
одна цепь ДНК – транскрибируемая
вторая цепь - смысловая
Стадии транскрипции:
инициации
элонгации
терминации

РНК-полимеразы

Инициация транскрипции
первый этап транскрипции, в ходе которого происходит связывание РНК-полимеразы с промотором и образование первой межнуклеотидной связи

У прокариот холофермент РНК-полимераза непосредственно узнает определенные последовательности нуклеотидных пар в составе промотора: последовательность 5-ТАТААТ-3 (расположена на расстоянии 10 нуклеотидов от точки начала транскрипции и называется боксом Прибнова) и последовательность 5-ТТГАЦА-3 (удалена от точки начала транскрипции на 35 нуклеотидов).
В некоторых оперонах, например в лактозном, необходимо предварительное взаимодействие с промотором дополнительного белка (САР изменяет структуру промотора, резко повышая его сродство к РНК-полимеразе)
Инициация транскрипции - прокариоты

РНК-полимеразы эукариот не способны самостоятельно связываться с промоторами транскрибируемых генов.
В присоединении к транскриптонам РНК-полимераз принимают участие общие факторы транскрипции (TF). Они отличаются от σ-факторов прокариот тем, что могут связываться с ДНК независимо от РНК-полимеразы. Полимеразы I, II и III требуют присутствия разных факторов транскрипции, обозначаемых TF I, TF II и TF III соответственно.
Инициация транскрипции - эукариоты

Промоторы эукариот устроены более сложно, чем прокариотические, и состоят из нескольких элементов. Из низ самым близким к точке начала транскрипции является ТАТА-домен, называемый также доменом Хогнесса. Затем следуют домены ЦААТ и ГЦ.
Домен ЦААТ играет существенную роль в инициации транскрипции, ТАТА и ГЦ, по-видимому, выполняют вспомогательные функции.
Инициация транскрипции - эукариоты

Связавшись с промотором, РНК-полимераза вызывает локальную денатурацию ДНК, т. е. разделение цепей ДНК на протяжении примерно 15 нуклеотидных пар. Образуется транскрипционный «глазок».
Первым в строящуюся цепь РНК включается пуриновый нуклеотид – АТФ или ГТФ, при этом все три его фосфатных остатка сохраняются.
После образования первой фосфодиэфирной связи σ-фактор у бактерий теряет связь с ферментом, и оставшийся core-фермент начинает перемещаться по ДНК.
РНК-полимераза эукариот после инициации транскрипции также теряет связь с транскрипционными факторами и перемещается по ДНК самостоятельно.
Инициация транскрипции

последовательное удлинение растущей цепи РНК.
перемещаясь вдоль двойной спирали ДНК, РНК-полимераза непрерывно раскручивает спираль впереди того участка, где происходит синтез РНК. На короткое время образуется так называемый открытый комплекс, внутри которого возникает РНК-ДНК-спираль длиной около 20 нуклеотидов.
затем фермент (с помощью специального сайта) вновь закручивает ДНК позади участка полимеризации.
РНК-транскрипт выводится из комплекса через особый канал, свойственный РНК-полимеразе.
Элонгация транскрипции

определяется особой нуклеотидной последовательностью ДНК, расположенной в зоне терминатора оперона.
В бактериальных оперонах выделяют два типа терминаторов:
ρ (ро) - независимые терминаторы (I типа);
ρ - зависимые терминаторы (II типа).
Терминация транскрипции

ρ-независимые терминаторы состоят из последовательностей, представляющих собой инвертированный повтор – палиндром, и располагаются за 16-20 нуклеотидных пар от точки терминации.
Палиндромы (последовательности, которые читаются одинаково слева направо и справа налево) содержат большое количество Г-Ц-повторов.
За этим участком на матричной цепи расположена олиго (А) - последовательность (4-8 адениловых нуклеотидов подряд).
Терминация транскрипции

Транскрипция в области палиндрома приводит к тому, что в получившемся РНК-транскрипте быстро образуется устойчивый элемент вторичной структуры – «шпилька» – спирализованная область, содержащая комплементарные Г-Ц-пары. «Шпилька» нарушает прочность связи ДНК-РНК в открытом комплексе.
Кроме этого транскрипция олиго(А)-последовательности в матричной цепи ведет к образованию участка ДНК-РНК-гибрида, составленного из непрочных А-У пар, что также способствует разрушению контакта между ДНК и РНК.
Терминация транскрипции

ρ-зависимые терминаторы.
Одним из факторов транскрипции прокариот является белок ρ. ρ-фактор – это имеющий четвертичную структуру белок, обладающий АТФ-азной активностью. Он способен связываться с 5-концом синтезируемой РНК длиной около 50 нуклеотидов.
ρ-фактор движется по РНК с такой же скоростью, с которой РНК-полимераза движется по ДНК. Вследствие того, что в терминаторе много Г-Ц-пар (с тремя водородными связями), РНК-полимераза в области терминатора замедляет ход, ρ-фактор ее догоняет, изменяет конформацию фермента, и синтез РНК прекращается
Терминация транскрипции

Процессинг РНК
Посттранскрипционная модификация РНК
совокупность процессов, которые приводят к превращению
первичного транскрипта в
зрелую РНК

Процессингу подвергаются:
мРНК, тРНК, рРНК эукариот
тРНК, рРНК прокариот
мРНК прокариот синтезируются
в активном виде!
Процессинг РНК

созревание сводится к разрезанию эндонуклеазами прерибосомной РНК на индивидуальные цепи, которые уже непосредственно участвуют в формировании рибосомы
Процессинг РНК. рРНК

Процессинг РНК. рРНК
Эукариоты:
метилирование оснований
нуклеазное расщепление – существуют четыре типа рРНК: 5S, 5,8S, 18S и 28S-рРНК. При этом 5S-рРНК синтезируется отдельно, а большая прерибосомная 45S-РНК расщепляется специфичными нуклеазами с образованием 5,8S-рРНК, 28S-рРНК (входят в состав большой субъединицы) и 18S-рРНК (малая субъединица рибосомы).
сплайсинг – в составе предшественника 28S РНК находятся интроны, которые удаляются в результате сплайсинга.

Прокариоты:
метилирование оснований
нуклеазное расщепление – молекулы рибосомальной РНК совсем иные по своим свойствам (5S-, 16S-, 23S-рРНК), образуются из 30S-прерибосомной РНК + несколько предшественников тРНК.
Процессинг РНК. рРНК

Процессинг РНК. тРНК
Эукариоты:
нуклеазное расщепление – удаление лидерной последовательности с 5'-конца, концевой с 3'-конца
сплайсинг – удаления интрона в средней части пре-тРНК и формирование антикодоновой петли
замена нуклеотидов на 3'-конце последовательностью ЦЦА. Для этого у одних пре-тРНК с 3'-конца удаляются лишние нуклеотиды до «обнажения» триплета ЦЦА, у других идет присоединение этой последовательности
модификация нуклеотидов в молекуле путем дезаминирования, метилирования, восстановления (образование инозина, метилуридина, псевдоуридина и дигидроуридина)

Процессинг РНК. тРНК
Прокариоты:
нуклеазное расщепление – удаление лидерной последовательности с 5'-конца, концевой с 3'-конца
замена нуклеотидов на 3'-конце последовательностью ЦЦА. Для этого у одних пре-тРНК с 3'-конца удаляются лишние нуклеотиды до «обнажения» триплета ЦЦА, у других идет присоединение этой последовательности.
модификация нуклеотидов в молекуле путем дезаминирования, метилирования, восстановления (образование инозина, метилуридина, псевдоуридина и дигидроуридина)

Процессинг РНК. тРНК

Пре-иРНК копирует всю нуклеотидную последовательность ДНК от промотора до терминатора транскриптона.
То есть она включает концевые нетранслируемые области
(5’ и 3'), интроны и экзоны.
Процессинг пре-иРНК включает в себя:
кэпирование,
полиаденилирование,
сплайсинг,
некоторые другие процессы (метилирование, редактирование).
Процессинг РНК. м(и)РНК

Кэпирование – это присоединение 7-метил-ГТФ (7-метилгуанозинтрифосфат) к 5'-концу РНК, а также метилирование рибозы двух первых нуклеотидов:
модификации пре-мРНК начинаются на стадии элонгации – ко-транскрипционно,
когда длина первичного транскрипта достигает примерно 30 нуклеотидных остатков, происходит кэпирование его 5'- конца.
Процессинг РНК. м(и)РНК

Функции:
защищает 5׳-конец мРНК от действия нуклеаз
обеспечивает правильное расположение мРНК на малой субъединице рибосомы при инициации трансляции
необходимо для работы сплайсосомы, обеспечивающей удаление интронов
Процессинг РНК. м(и)РНК

Полиаденилирование – при помощи полиаденилат-полимеразы с использованием молекул АТФ происходит присоединение к 3'-концу РНК от 100 до 200 адениловых нуклеотидов, формирующих полиадениловый фрагмент – поли(А)-хвост.
Поли(А)-хвост:
необходим для защиты молекулы РНК от экзонуклеаз, работающих с 3'-конца,
способствует экспорту мРНК из ядра,
определяет время жизни РНК.
Процессинг РНК. м(и)РНК

https://youtu.be/fMnxyWvyZpY
Процессинг РНК. м(и)РНК

Сплайсинг – вырезание интронов из пре-мРНК и сшивание экзонов с образованием мРНК
Осуществляется сплайсосомой – комплексом белков и малых ядерных РНК (мяРНК):
U1, U2, U4, U5, U6
Процессинг РНК. м(и)РНК

Точное разрезание границы интрон/экзон определяют три типа коротких последовательностей – сайты сплайсинга:
5’SS (донорный) exon-G-U
3’SS (акцепторный) A-G-exon
BS – бранч-сайт (сайт разветвления) – внутри интрона, около 30 нуклеотидов в обратном направлении от сплайс-акцептора А
Процессинг РНК. м(и)РНК

Процессинг РНК. м(и)РНК
В результате экзоны оказываются ковалентно соединенными обычной межнуклеотидной связью, а интрон уходит в виде структуры «лассо»

Процессинг РНК. м(и)РНК

https://youtu.be/vL1P7U5Bhx8
Процессинг РНК. м(и)РНК

Альтернативный сплайсинг –
процесс, в результате которого первичный транскрипт может сплайсироваться разными способами и давать начало разным мРНК
Процессинг РНК. м(и)РНК

Функциональное:
поддержание белкового разнообразия
Человек: ~20.000 генов, >100.000 белков
Разнообразие белков у млекопитающих повысилось не за счет роста числа генов, а за счет развития альтернативного сплайсинга и роста числа изоформ – они разные в разных тканях
Эволюционное:
альтернативный сплайсинг – это способ попробовать новые формы белков, не жертвуя старыми
Процессинг РНК. м(и)РНК

Транс-сплайсинг
особая форма процессинга РНК у эукариот, в ходе которого экзоны из двух разных первичных транскриптов РНК соединяются конец к концу
нематоды, динофлагелляты
Процессинг РНК. м(и)РНК

Аутосплайсинг –
осущестляется без участия каких-либо белков, катализатором реакции становятся сами интроны РНК
Выявлен для генов рРНК у примитивных эукариот
(Tetrahymena), мРНК и тРНК митохондрий и хлоропластов
Процессинг РНК. м(и)РНК

Редактирование – это изменение нуклеотидной последовательности РНК
Редактирование РНК включает:
модификацию азотистых оснований, например, дезаминирование цитозина (С) в уридин (U), аденозина (A) в инозин,
вставка нуклеотидов без ДНК-матрицы.
Тканеспецифично.
Может быть связано с деградацией РНК, может приводить к появлению новых изоформ белка, механизм защиты от ретротранспозонов.
Процессинг РНК. м(и)РНК

* синтез белка на рибосомах, направляемый матрицей РНК
Трансляция мРНК
Стадии:
активация аминокислот, или предварительный этап, или рекогниция
собственно трансляция:
инициация
элонгация
терминация

Проходит в цитоплазме
Активация аминокислот – взаимодействие аминокислот с АТФ с образованием комплексов (аминоациладенилатов) под воздействием специфических ферментов аминоацил-тРНК-синтетаз.
Аминоацилирование тРНК – присоединения аминокислотных остатков к тРНК (аминоацил-тРНК-синтетазы). Каждый аминокислотный остаток присоединяется к своему специфическому классу тРНК.
Трансляция мРНК. Подготовительный этап

Трансляция мРНК. Подготовительный этап
Для биосинтеза белка в клетке необходимы источники энергии, которые смещали бы равновесие реакции в сторону полимеризации. Таким источником является АТФ. Тратится 2 макроэргические связи. Поэтому энергии аминоацил-тРНК с избытком хватает на образование пептидной связи.

Трансляция мРНК. Полимеризация
В рибосоме выделяют
А-участок (аминоацильный), куда приходят новые аминоацил-тРНК, и
Р-участок (пептидильный), где в момент прихода новой аминоацил-тРНК находится растущий пептид.
Иногда выделяют также Е-участок (от empty — пустой), в котором оказываются уже отдавшие аминокислоту, «пустые» тРНК.

Связывание малой субъединицы рибосомы с мРНК.
Нахождение инициаторного, или стартового, кодона АУГ, как правило, это первый АУГ с 5'-конца мРНК
Установка метионил-тРНК (или формилметионил-тРНК у прокариот) в Р-участок рибосомы, привлечение следующей аминоацил-тРНК, присоединение большой субъединицы и сборка полной рибосомы. Процесс инициации обеспечивается специальными белками – факторами инициации.
Трансляция мРНК. Полимеризация. Инициация

Трансляция мРНК. Полимеризация. Инициация
Механизмы инициации трансляции у про-и эукариот существенно отличаются:
прокариотические рибосомы потенциально способны находить стартовый AUG и инициировать синтез на любых участках мРНК,
эукариотические рибосомы обычно присоединяются к мРНК в области кэпа и сканируют её в поисках стартового кодона.

Прокариоты:
присоединение к МС рибосомы факторов инициации IF2-GTP (взаимодействует с тРНК), IF1 (повышает сродство МС к IF2-GTP, IF3), IF3 (препятствует связыванию с БС)
узнавание МС последовательности Шайна-Дальгарно на мРНК (комплементарное связывание с 16SрРНК)
узнавание стартового кодона АУГ
присоединение инициаторной тРНК с первой АК
присоединение БС, гидролиз ГТФ, диссоциация инициаторных факторов
Последовательность Шайна-Дальгарно (англ. Shine-Dalgarno sequence, Shine-Dalgarno box) – сайт связывания рибосом на молекуле мРНК прокариот, обычно на расстоянии около 10 нуклеотидов до стартового кодона АУГ.
Трансляция мРНК. Полимеризация. Инициация

Эукариоты:
а) кепзависимый (сканирующий) механизм:
присоединение МС рибосомы с инициирующими факторами eIF3, eIF1 и eIF2/GTP/Met-tRNAiMet к 5-концу в области кепа, движение вдоль молекулы м РНК
узнавание МС рибосомы последовательности Козак на мРНК и стартового кодона АУГ
присоединение инициаторной тРНК с первой АК
присоединение большой субъединицы, гидролиз ГТФ, диссоциация инициаторных факторов
Консенсусная последовательность Козак – последовательность в мРНК – включает 4-6 нуклеотидов, предшествующих старт-кодону, и один-два нуклеотида непосредственно после старт-кодона.
Трансляция мРНК. Полимеризация. Инициация

Эукариоты:
б) кепнезависимый (внутренняя инициация) механизм:
присоединение МС рибосомы с инициирующими факторами на внутренний участок мРНК – IRES (хорошо выражена вторичная структура), которые чаще всего располагаются в 5'-нетранслируемой области (5'-НТО) недалеко от сайта инициации трансляции, минуя стадии узнавания кэпа и сканирования
присоединение инициаторной тРНК с первой АК
присоединение большой субъединицы, гидролиз ГТФ, диссоциация инициаторных факторов
Трансляция мРНК. Полимеризация. Инициация

В клетках IRES отвечают за посадку рибосом как на кэпированные, так и на некэпированные транскрипты в тех случаях, когда кэпзависимая инициация трансляции заингибирована (при стрессе, на определённой стадии клеточного цикла или при апоптозе), и тем самым обеспечивают непрерывный синтез необходимых белков.
Трансляция мРНК. Полимеризация. Инициация

Трансляция мРНК. Полимеризация. Инициация

Представляет собой цикл из 3 повторяющихся событий:
присоединение новой аминоацил-тРНК в А-участок в соответствии с кодоном, который там оказался (кодон мРНК компелементарен антикодону тРНК)
образование пептидной связи – транспептидация – с перевешиванием растущего пептида с тРНК в Р-участке на новопришедшую аминоацил-тРНК в А-участке за счет каталитической активности БС рибосомы (работает как рибозим)
транслокация – шаг рибосомы на один триплет в сторону 3'-конца мРНК. Всё, что было в А-участке, оказывается в Р-участке, а А-участок теперь свободен для присоединения новой аминоацил-тРНК. Свободная тРНК уходит через Е-сайт
Трансляция мРНК. Полимеризация. Элонгация

Факторы элонгации:
Первый фактор – EF1a у эукариот, EF-Tu – у прокариот – переносит аминоацилированную («заряженную» аминокислотой) тРНК в А-сайт рибосомы.
Второй белок – EF2 у эукариот, EF-G – у прокариот катализирует транслокацию.
Трансляция мРНК. Полимеризация. Элонгация

Трансляция мРНК. Полимеризация. Элонгация

Трансляция мРНК. Полимеризация. Терминация
Окончание синтеза белка, осуществляется, когда в А-сайте рибосомы оказывается один из стоп-кодонов – УАГ, УАА, УГА.
Из-за отсутствия тРНК , соответствующих этим кодонам, пептидил-тРНК остаётся связанной с Р-сайтом рибосомы. Здесь в действие вступают специфические белки RF1 или RF2, которые катализируют отсоединение полипептидной цепи от мРНК, а также RF3, который вызывает диссоциацию мРНК из рибосомы. RF1 узнаёт в А-участке УАА или УАГ; RF-2 – УАА или УГА.
С УАА терминация эффективнее, чем с другими стоп-кодонами.

Трансляция мРНК. Полимеризация. Терминация

Трансляция мРНК. Полимеризация
Часто на одной мРНК последовательно друг за другом синтезируют белок несколько рибосом.
Это позволяет более эффективно использовать мРНК и синтезировать в единицу времени больше белковых молекул.
ПОЛИСОМЫ – структуры, состоящие из одной мРНК и нескольких работающих на ней рибосом.

Трансляция мРНК. Локация
Прокариоты:
во время транскрипции в нуклеоиде или цитоплазме
Эукариоты:
в цитоплазме или гранулярной ЭПС
независимо от транскрипции и процессинга

Посттрансляционная модификация – это ковалентная химическая модификация белка после его синтеза на рибосоме
Завершает процесс биосинтеза белка!
Увеличивает разнообразие белков в клетке!
Известно более двухсот вариантов посттрансляционной модификации белков
Модификациям подвергается подавляющее большинство белков
Один и тот же белок может подвергаться нескольким различным модификациям
Пострансляционная модификация

К основным реакциям процессинга относятся:
удаление с N-конца метионина или даже нескольких аминокислот специфичными аминопептидазами
образование дисульфидных мостиков между остатками цистеина
частичный протеолиз – удаление части пептидной цепи, как в случае с инсулином или протеолитическими ферментами ЖКТ
объединение протомеров в единый олигомерный белок (гемоглобин, коллаген, лактатдегидрогеназа, креатинкиназа)
Пострансляционная модификация

присоединение химической группы к аминокислотным остаткам белковой цепи:
фосфорной кислоты – к сер, тре, тир используется при регуляции активности ферментов или для связывания Са
карбоксильной группы – при участии витамина К происходит γ-карбоксилирование глу в составе факторов свертывания, что позволяет связывать Са
метильной группы – метилирование арг и лиз в составе гистонов используется для регуляции активности генома
гидроксильной группы – к лиз и про необходимо для созревания молекул коллагена при участии витамина С,
йода –необходимо для образования предшественников тиреоидных гормонов йодтиронинов
Пострансляционная модификация

включение простетической группы:
углеводных остатков – гликирование требуется при синтезе гликопротеинов.
гема – при синтезе гемоглобина, миоглобина, цитохромов, каталазы,
витаминных коферментов – биотина, ФАД, пиридоксальфосфата и т.п.
Пострансляционная модификация

Фолдинг – это процесс укладки вытянутой полипептидной цепи в правильную трехмерную пространственную структуру.
Для обеспечения фолдинга используется группа вспомогательных белков под названием шапероны (chaperon, франц. – спутник, нянька).
Они предотвращают взаимодействие новосинтезированных белков друг с другом, изолируют гидрофобные участки белков от цитоплазмы и «убирают» их внутрь молекулы, правильно располагают белковые домены.
Пострансляционная модификация

Пострансляционная модификация

Пострансляционная модификация

Пострансляционная модификация