Обмен азота. Пути синтеза аминокислот. Лекция 3

Как живые организмы получают азот?

ЦИКЛ АЗОТА В БИОСФЕРЕ
СИНТЕЗ АМИНОКИСЛОТ,
по учебнику Анисимова п. 5.1 и 5.2 по: Нельсон, Кокс т.2, стр.6 и стр. 506-509. О нитратах читать “Практикум по биохимии”

Для синтеза заменимых аминокислот человеку и животным подходит только NH3 (в воде NH4OH, NH4+)

Источники аммиака
Фриц Габер, Карл Бош – Нобелевская премия 1918 и 1931 соответственно за создание технологии промышленного получения аммиака
но...+5000С, 300-350 атм.

Цикл азота в биосфере
1) диазотрофы 2) нитрификация (бактерии) 3) поглощение и ассимиляция NH4+ и NO3- 4) поедание организмов другими и отмирание организмов 5) аммонификаторы, минерализация азота 6) денитрификаторы

1. Фиксация NΞN. НИТРОГЕНАЗА
БАКТЕРИИ – диазотрофы:
- свободноживущие (рр. Azotobacter, Clostridium, все фотосинтезирующие, ряд АРХЕЙ…)
- в симбиозе или ассоциации с растениями (рр. Rhizobium, Azospirillum, Anabaena, Frankia …)
- в кишечнике животных
(р. Кlebsiella…)
Azotobacter
Rhizobium на люпине
60% N в теле термита –
продукт азотфиксации
бактерий пищеваритель-ного тракта

Повсеместность азотфиксации
1895 - Наббе, Хилтнер – патент на микробное удобрение Nitragin (культуры азотфиксаторов для разных растений)
Кроме бобовых, активно фиксируют N ризосферные и симбиотические бактерии у березы, облепихи, малины, ольхи, ивы, дикие и культурные злаки...
В год на 1 га почвы в умеренных широтах:
Свободноживущие микроорганизмы - 15-30 кг N
Симбионты – 200-300 кг N.

Общая схема азотфиксации
У Rhizobium для восстановления 1N2 может идти от 12 до 35 АТФ – для 12 АТФ см. Анисимов с. 247
Побочная реакция при азотфиксации – восстановление Н+ до Н2. В результате только 40-60% всего потока е- через нитрогеназу передается на N2. Как убрать ненужные потери?

Легоглобины – защита от О2
Из люпина
Миоглобин кашалота

“Из аммиака в аммонийную форму” - работает нитрогеназный комплекс (упрощенно называемый нитрогеназой).
Комплекс состоит из 2х видов белков:
1) Азоферредоксин = дегидрогеназа или редуктаза динитрогеназы = Fe-белок. Он переносит электроны от доноров (белка ферредоксина) на MoFe-белок. Содержит Fe и S в FeS-кластерах .
2) Молибдоферредоксин = динитрогеназа = MoFe-белок (FeMo-белок). Именно он связывает и восстанавливает N. Содержит Mo, Fe и S (МоFe-кофактор)

Нитрогеназный комплекс
Fe-белок (редуктаза динитрогеназы) – каждый из 2х - димер
MoFe-белок (динитрогеназа) - тетрамер, имеет 2 центра
связывания Fe-белка
У Clostridium, Azotobacter и Anabaena бывают нитрогеназы, содержащие ванадий, у Azotobacter, Rhodobacter и Rhodopseudomonas – содержащие Fe.

Кластеры нитрогеназы

FeS-центры в Fe-белке
Р-кластер (8Fe-7S)
4Fe-4S-кластер

MoFe-кофактор: что в центре?
Атомы:
cерые – Fe (7),
желтые – S (9),
черные – С,
подписан Мо (1),
обведен голубым – недавно выявленный С.
T. Spatzal et al Evidence for Interstitial Carbon in Nitrogenase FeMo Cofactor // Science. 2011. V. 334. P. 940.

Работа нитрогеназы
N2 + 8H+ + 8e + 16АТФ→ 2NH3 + H2 + 16АДФ + 16Фн

Расшифровка к предыдущему слайду
В молекуле Fe-белка (димере) 1 FeS-центр, поэтому Fe-белок может переносить только по 1 электрону, получая их от ферредоксина. Ферредоксин может получать электроны от ПВК (пирувата). В FeS-белке 2 центра связывания АТФ, поэтому он может связать 2АТФ, которые (обе) расходуются при переносе 1 электрона.
В МоFe-белке 2 атома Мо, 2 FeS-центра и МоFe-кофактор. Фиксировать азот может только полностью восстановленный МоFe-белок. Для полного восстановления МоFe-белка нужно 8 электронов. Их по одному доставляет Fe-белок, суммарно затрачивая на перенос 8 х 2 АТФ = =16АТФ.

Ферредоксины (Фд, Fd)
Ферредоксины (ferrum — железо; сокращённо обозначается «Фд») — группа небольших (6—12 кДа) растворимых белков, являющихся подвижными переносчиками электронов в ряде метаболических процессов. Обычно они переносят один или два электрона за счёт изменения окисленности атомов железа.

Дополнительный материал
Направления исследований:
1) Разработка технологий для сельского хозяйства на базе изучения физиологии и биохимии азотфиксаторов, закономерностей азотфиксации
2) Создание генноинженерным путем азотфиксирующих растений и микроорганизмов – на базе изучения генетики азотфиксации. Но защита от кислорода!
3) Конструирование улучшенных нитрогеназ (дающих больше NН4+ или Н2 (по желанию человека) – на базе познания физических и физико-химических основ азотфиксации и энзимологии.
3) Генноинженерное улучшение создания симбиоза азотфиксаторов с растениями – на базе познания биохимических механизмов стадий распознавания хозяина, неотторжения симбионта.
4) Поиск новых, более эффективных симбиозов такого рода в природе

Дополнительный материал: Гены и белки азотфиксации
Вершинина З.Р., Баймиев Ал.Х., Чемерис А.В. Симбиотические реакции корней облепихи, трансгенных по гену лектина гороха посевного// Физиология растений, 2010, том 57, № 1 (Ин-т биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН – трансгенная облепиха, “приманивающая” ризобий гороха

ПУТИ СИНТЕЗА АМИНОКИСЛОТ Семейства аминокислот по происхождению

Из аммиака в аминокислоты

РАСТЕНИЕ: поглощение и переработка NH4+ из почвы (или от симбионтов)
Дополнит. информация:2 типа транспортных систем:
если аммония мало – система высокого сродства (аммонийный транспортер АМТ, антипорт с Н+), несколько разных АМТ.
если аммония много – система низкого сродства (ионный канал).
Внутри растения –
аминирование, амидирование...
У животных эти процессы тоже происходят

Прямое восстановительное аминирование – 1 путь синтеза а-к-т
Фермент – глутаматдегидрогеназа (глутаматДГ)
НАДН – никотинамид-аденин-динуклеотид в восстановленной форме

Образование глутамина – 1а путь синтеза
Фермент - глутаминсинтетаза

Переаминирование – 3 путь синтеза аминокислот
Ферменты переаминирования – аминотрансферазы
(например, аланин-амино-трансфераза (АлАт), аспартатаминотрансфераза (АсАт)

3 путь синтеза аминокислот -
ферментативные превращения
1) Семейства аминокислот 1 – 4 (на основе α-кетоглутаровой к-ты, ПВК, 3-ФГК и ЩУК.
2) Гистидин
3) Ароматические аминокислоты (шикиматный путь) (семейство 5)
!!! У ЖИВОТНЫХ ДЛЯ СИНТЕЗА НЕЗАМЕНИМЫХ АМИНОКИСЛОТ
НЕТ НЕОБХОДИМЫХ ФЕРМЕНТОВ. ПРИ САМОПОДГОТОВКЕ
ОТМЕТЬТЕ НА СХЕМАХ СЕМЕЙСТВ НЕЗАМЕНИМЫЕ!

Семейства аминокислот 1-4

Гистидин – особый путь
! У животных гис не синтезируется

Семейство 5 (ароматические) – по шикиматному пути
1) синтез дегидрохинной кислоты (дегидрохинната), у большинства видов - из эритрозо4Ф и ФЕП.
2) синтез шикимовой кислоты из дегидрохинната
3) синтез фенилаланина, тирозина, триптофана

1) Основной путь синтеза дегидрохинната

Главные ступени синтеза аминокислот из шикимата
! У животных фен и три – не синтезируются, тир может
синтезироваться только при наличии фен

Шикиматный путь (начиная с дегидрохинната)

ИТОГО: основные пути синтеза белковых аминокислот
1) прямое восстановительное аминирование
1а) – образование амидов
2) переаминирование
3) ферментативные превращения

Ферментативные превращения в синтезе аминокислот
1) Семейства аминокислот 1 – 4 (на основе α-кетоглутаровой к-ты, ПВК, 3-ФГК и ЩУК.
2) Гистидин
3) Ароматические аминокислоты (шикиматный путь) (семейство 5)
!!! У ЖИВОТНЫХ ДЛЯ СИНТЕЗА НЕЗАМЕНИМЫХ АМИНОКИСЛОТ
НЕТ НЕОБХОДИМЫХ ФЕРМЕНТОВ. ОТМЕТИТЬ НА СХЕМАХ
СЕМЕЙСТВ НЕЗАМЕНИМЫЕ!

Семейства аминокислот 1-4

Гистидин – особый путь
! У животных гис не синтезируется

Семейство 5 (ароматические) – по шикиматному пути
1) синтез дегидрохинной кислоты (дегидрохинната), у большинства видов - из эритрозо4Ф и ФЕП.
2) синтез шикимовой кислоты из дегидрохинната
3) синтез фенилаланина, тирозина, триптофана

1) Основной путь синтеза дегидрохинната

Главные ступени синтеза аминокислот из шикимата
! У животных фен и три – не синтезируются, тир может
синтезироваться только при наличии фен

Шикиматный путь (начиная с дегидрохинната)

Нитрификация:
1) автотрофная (бактерии сем. Nitrobacteriaceae, археи), при окислении аммиака получающие энергию в виде АТФ, которую используют для фиксации СО2.
2) гетеротрофная (бактерии, грибы) – энергии
не получают, процесс нужен для защиты от NH4+, свободных радикалов и др.
Если не в аминокислоты – то куда?

Автотрофная нитрификация у бактерий
a) NH4+ в клетку – транспортный белок Сu-содержащая транслоказа
б) образование нитрита через гидроксиламин (один набор видов бактерий)
NH3 + O2 + НАДН + Н+ = NH2OH + H2O + НАД+ - Сu-содержащий фермент монооксигеназа
NH2OH + O2 = NO2- + H2O + H+ - Работает дыхательная ЭТЦ (с FeS-белками-цитохромами), из-за чего выделяется энергия и запасается в виде АТФ.
в) образование нитрата из нитрита (другой набор видов) – Mo-зависимая мембраносвязанная НИТРИТРЕДУКТАЗА.
и ЭТЦ (с FeS-белками-цитохромами).
NO2- + 0,5 O2 → NO3- +177,4 кДж/моль.

Денитрификация (из нитрата в N2)

Денитрификация. Анаммокс
Недавнее открытие (1999г) – возможность окисления аммиака бактериями в анаэробных условиях
NH4++NO2- = N2 + 2H2O

Бактерии АНАММОКС – загадка на загадке...
- до сих пор не выделены в чистую культуру (“кандидаты” в виды)
- нуклеоид в мембранной “оболочке” (рибоплазма - ядро?)
- анаммоксисома (до 50-70% объема клетки), в ее мембране липиды-ладдераны (ladder – лестница), защита от гидразина NH2-NH2 (диамид, диамин)
- не они ли LUCA - Last Universal Common Ancestor?

Селеноцистеин
(Sec)
Формилметионин

Синтез формилметионина –
прямо на тРНК, в 2 стадии

Селеноцистеин образуется из серина прямо на тРНК

γ-аминомасляная кислота (ГАМК)
основной нейромедиатор торможения, рецепторы ГАМК A и ГАМК C – ионные каналы, активация которых блокирует передачу нервного импульса
усилитель усвоения и переработки глюкозы в ЦНС (→ больше АТФ)
В 2007 г. рецепоры ГАМК найдены и в эпителии дых. путей (участие в развитии астмы?).
КФ 4.1.1.15, активна в основном в сером веществе мозга, кофактор ПЛФ
Сигнальная функция (ГАМК) и предшественник (глу)

Синтез нетипичных аминокислот ПОСЛЕ построения белка
РЕАКЦИИ
- Ацилирование (метилирование и др.) по –NH2-группе бокового радикала ЛИЗ и АРГ – для нейтрализации +‘ заряда
- фосфорилирование по –OH группе СЕР и ТРЕ – для приобретения ‘–‘ заряда
- фарнезилирования остатков ЦИС (например, в G-белках) для закрепления их в мембране. Присоединяется изопрен из фарнезил-пирофосфата – промежуточного продукта синтеза холестерина.
НУЖНО:
- для выполнения функций,
- регуляции функционирова-ния
- определения местоположе-ния белка-мишени.
Появление ОН- важно для сшивок между коллагеновы-ми волокнами
ɣ-карбоксиглу-таминовая к-та

Роль ɣ-карбоксиглутаминовой кислоты
в улучшении связывания Са2+
Образуется ПОСЛЕ ТРАНСЛЯЦИИ (из ГЛУ, находящейся уже в составе белка) в N-области протромбина.. Появление еще одной СООН-группы нужно для улучшения связывания ионов Са2+, что важно для инициации свертывания крови
Фермент - глутаминкарбоксилаза

Mucuna (сем. Бобовые) – зудящие бобы
Гриффония (Griffonia simplicifolia, сем. Бобовые)
3,4-дигидроксифенилаланин
5-гидрокситриптофан
Ландыш, юкки
ЗАЩИТА. Аминокислоты - токсины
цианаланин

как в синтезе серотонина

Синтез азетидин-2-карбоновой кислоты
Convallaria majalis (до 7% сухого веса листьев). Очень мало – в сахарной свекле.
У ряда Streptomyces - антибиотик и сильный токсин для человека.

Синтез β-циан(о)аланина - токсина
β-циан-L-аланин синтаза КФ 4.4.1.9
(L-цистеин-сероводород-лиаза (добавляющая HCN), ее кофактор пиридоксальфосфат
бобовых (Lupinus angustifolia, Lathyrus cicera и др., виды р. Vicia). При питании вызывает латиризм – параличи у человека и животных из-за нейротоксического действия на спинной мозг (Франция, Италия, Алжир, Ост-Индия).