Паратрансгеноз. Варианты конструкций, используемых для трансгеноза

Паратрансгеноз (paratransgenesis)
[лат. para — возле, при, вне, trans(ferre) — переносить и греч. genesis — происхождение] — метод переноса экзогенного генетического материала в целые организмы с помощью бактерий-симбионтов или вирусов-симбионтов. П. направлен на подавление патогена в перенос-чиках инфекций, приводящих к различным заболеваниям. Напр., с помощью генетически модифицированной бактерии Sodalis были получены мухи це-це, устойчивые к инфекции трипаносомами, которые являются возбуди-телями малярии. Метод предложен Ч. Бирдом с соавт. в 1993 г.

Энхансер целевого гена
Промотор целевого гена
Репортерный ген
(люцифераза, бета-галактози-даза, термостабильная щелоч-ная фосфатаза, цветные белки)
Терминатор целевого гена
Структура вектора, используемого для изучения регуляции генов

Экспрессия трансгена у эмбрионов вьюна с геном СMV-lacZ через сутки после оплодотворения (окраска X-gal)
Контроль

Структура вектора, используемого для изучения фенотипических эффектов генов
Регуляторные последователь-ности, обеспечивающие специфическую или универсальную экспрессию
Целевой ген
Эффективный терминатор

Трансгенная мышь с геном гормона роста человека
Контроль

Другие яркие примеры:
Трансгенная «супермышь» с геном фосфоэнолпируват-карбоксилиназы (участвует в обмене глюкозы) –пробегает без остановки более 5 км (2008 г.)
Трансгенная мышь с геном Fra-1 (серин-треониновая фосфатаза, защищает клетки от свободных радикалов) - «супердетоксицирующая» модель. Повышенное производство Fra-1 в печени защищает этот орган от разрушения повышенным дозами различных лекарствами, например, парацетамола (2013 г.)

Варианты конструкций, используемых для трансгеноза
Для изучения функций генов
Универсальные промоторы: МТ, SV40, CMV, RSV
Индуцируемые промоторы: LTR MMTV - дексаметазон, MT – цинк, Tet - тетрациклин, AlcR – газ, содержащий ацетальдегид.
Тканеспецифические промоторы: глобиновый (кровь), ApoE (печень), иммуноглобулиновый (лимфоциты), тирозингидроксилазный (мозг)
Стадиеспецифические промоторы: альфа1-коллагеновый (на 9-ый день развития), альфа1-кристаллиновый (на 13-тый день развития)
Для изучения регуляции экспрессии генов
Гены-репортеры: lacZ, GFP, RFP, люцефераза
Для целенаправленного синтеза белка
Тканеспецифические промоторы: бета-лактоглобулина (молоко), бета-казеиновый (молоко), глобиновый (кровь).

Тканеспецифическая транскрипция трансгенов

Стадиеспецифическая экспрессия трансгенов

Измененная ткнеспецифичность экспрессии трансгенов

Механизмы трансгеноза

Схема расположения трансгенов в местах интеграции с геномом
Голова-хвост
Голова-голова
Наши данные: S-фаза,
Репликаторы генома

Эффект инсерции трансгена на структуру хозяйской ДНК

Изменения в структуре трансгенов в F0-поколении трансгенных мышей

Перестройка структуры трансгена при передаче по наследству

Блот-гибридизация (по Саузерну)

«Спасение плазмиды»
Трансген
Ampr
Ген устойчивости к антибиотику (из плазмиды)
Геномная ДНК
ЕcoRI
Е
Трансформация клеток E. coli
Отбор бактериального клона на среде с антибиотиком
Секвенирование «спасенного» фрагмента

Инсерционные мутации в «классических» локусах у трансгенных мышей

Инсерционные мутации у трансгенных мышей в ранее неизвестных локусах

альфа 2-коллагеновый ген
Линия мышей Mov-13 (гомозиготы погибают на 12-ые сутки развития)

Трансгеноз и сельскохозяйственные животные

Трансгенные с/x животные с измененными свойствами
Трансген Промотор Животное Новое свойство
Гормон роста МТ Свинья Ускоренный рост тела
Инсулинподобный Кератин Овца Ускоренный рост волос фактор роста
Фитаза Амилаза Свинья Пониженное содержание фосфора в навозе Антисенс-РНК ЦМВ Кролик Устойчивость к вирусу вируса лейкоза КРС к вирусу лейкоза
Нокаут гена приона - Овца Устойчивость к вирусу скрепи
CD59/hDAF/hMCP ЦМВ Свинья Улучшение бббббббббббббббббббббббббббб ксенотрансплантации
β- и κ-казеины Казеин Корова Улучшение свойств молока
siРНК к β-лактоглобулину тРНК Корова Гипоаллергенное молоко

Трансгенные животные – биореакторы
Трансген Промотор Животное
Фактор крови IX α- лактоглобулина Овца
Фактор крови VIII α- лактоглобулина Овца
Лактоферрин α-казеина Корова
Активатор плазминогена белка сыворотки Коза
α1-антитрипсин β-лактоглобулина Овца
Интерлейкин 2 β-казеина Кролик
Антитромбин III β-казеина Овца
-глюкозидаза S1-казеина Кролик
Белок С WAP Свинья
Альбумин WAP Овца
Фибриноген β-лактоглобулина Овца
α-фетопротеин β-казеин Коза
ГМСФ β-казеин Коза

"Фарминг" - фармакологическая фабрика на ферме
ПОДСЧИТАНО:
- Белок C - предотвращает образование тромбов и необходим при инфаркте, инсульте, тромбофлебите и т. д. Продуктивная корова дает в год 10 тонн молока. Если с помощью трансгеноза концентрация белка C в молоке будет составлять 2 г/л, а эффективность очистки - 50%, то стадо из десятка коров обеспечит этим лекарством всех нуждающихся.
- «Фактора Кристмаса» (F-IX) - белка, который запускает каскадный механизм свертывания крови (по $40 тыс. за грамм). Еще один фактор свертывания крови, F-VIII, в пересчете на грамм обойдется в $2,9 млн.! Обеспечить каждым из этих белков всех гемофиликов земли может всего десяток трансгенных буренок.

2. Чужеродные гены из пищи ни при каких условиях не могут быть встроенными в геном организма и привести к мутациям.
3. Аллергия и другие возможные побочные эффекты не подтверждены экспериментально, они скорее могут быть вызваны немодифицированными продуктами питания.
4. Существует более строгий контроль на использование генетически модифицированной пищи, чем обычной.
1. Не следует пугаться слов «генетически модифицированный» – все живое в природе постоянно подвергается изменениям такого рода. Человек, в данном случае, просто выступает в качестве «руководителя» и «ускорителя» – остается только уповать на его разумность.
Опасны ли генетически модифицированные продукты?

По данным AAAS (2012 г.), Европейский Союз потратил на исследования биобезопасности ГМ-организмов более 500 миллионов евро, и основной вывод, изложенный в последнем докладе ЕС, гласит: "биотехнология, и в частности, генетическая модификация сама по себе не более рискованна, чем обычные методы селекции растений".
Заключение сделано по результатам 130 исследовательских проектов, выполняемых на протяжении 25 лет 500 независимыми группами ученых.
Официальное заключение