Полимеразная цепная реакция и методы детекции ПЦР-продуктов

План лекции
Общие сведения о ПЦР
Применение ПЦР
Стадии проведения ПЦР анализа
MasterMix и обзор некоторых его компонентов
Матрица
Праймеры
ДНК-полимеразы
Амплификаторы и требования к лабораториям
Условия проведения ПЦР
Схема ПЦР
Разновидности ПЦР
Особенности количественной ПЦР в реальном времени
Способы детекции результатов ПЦР
Гель-электрофорез

ПЦР – полимеразная цепная реакция, [греч. polymeres — состоящий из многих частей, многообразный; лат. re- — приставка, обозначающая повторность действия, и actio — действие] — ферментативная реакция, осуществляемая in vitro с помощью термостабильной ДНК-полимеразы на матрице ДНК с использованием олигонуклеотидных ДНК-затравок (праймеров), комплементарных нуклеотидным последовательностям противоположных цепей ДНК на границах амплифицируемого участка
Амплификация – увеличение числа копий ДНК
Ампликоны – продукты ПЦР, синтезируемые в процессе амплификации копии ДНК-мишени
Отжиг – присоединение праймеров к одноцепочечной ДНК-мишени

Полимеразная цепная реакция
ПЦР, polymerase chain reaction - PCR
1983 г. К. Мюллис (Kary Mullis,1993 г. – Нобелевская премия по химии)
в основе – принципы и механизмы естественной репликации ДНК
позволяет амплифицировать (многократно увеличить количество копий, клонировать) in vitro фрагмент ДНК с известной последовательностью нуклеотидов
амплификатор, термоциклер

Применение ПЦР
Используется:
в диагностике инфекционных заболеваний
для определения генотипа организма
для изучения экспрессии генов и сравнения экспрессии разных аллелей
для идентификации личности
для установления родственных связей
в ветеринарии
в экспертизе продуктов питания
в молекулярно-биологических и молекулярно-генетических исследованиях (создание рекомбинантных ДНК, исследование мутагенеза клонированной ДНК, гибридизация с аллель-специфическими зондами и т.д.)
с помощью ПЦР удалось амплифицировать фрагменты мтхДНК из ископаемых останков мозга человека возраста 7 тысяч лет

Стадии проведения ПЦР - анализа
1. Выделение генетического материала из клинического образца
2. Амплификация специфического фрагмента ДНК
3. Детекция продуктов амплификации

MasterMix
праймер R
праймер L
буфер 10х
смесь dNTP
матрица (ДНК)
вода деионизированная
ДНК-полимераза (Taq-полимераза)
вазелиновое масло (?)
Общий объем 25-100 мкл

пригоден минимально обработанный исходный биологический материал, даже частично разрушенный (цельная кровь, пятна высохшей крови, смывы из ротовой полости, старые срезы тканей и т.д.)

Праймеры
длина 18-30 п.н. (ДНК!)
GC-состав ≈ 40—60%
R- и L-праймеры не должны быть комплементарны друг другу
t отжига более 55°С и менее 60°С желательно
отсутствие неспецифических вторичных структур — шпилек и димеров
3’-конец - G или C, т.к. они образуют три водородные связи с молекулой матрицы, делая гибридизацию более стабильной

Полимеразы для ПЦР
Taq – полимераза (Thermus aquaticus, обитают в горячих источниках), лишена 3’-экзонуклеазной автивности
Pfu-полимераза (Pyrococcus furiosus, «яростные огненные шарики», экстремально термофильные бактерии, до 103°С), обладает 3’-экзонуклеазной автивностью, но медленно работает

Для охлаждения и нагрева матрицы используются термоэлектрические элементы Пельтье:
точность регулирования температуры
бесшумность
хорошие массогабаритные показатели
высокая надежность
каждый элемент имеет свой датчик температуры и свой терморегулятор → позволяет задавать необходимые температурные градиенты по матрице

Некоторые требования к лабораториям
Лаборатория в соответствии с этапами проведения анализа должна включать следующий набор последовательно расположенных самостоятельных рабочих зон (помещений) или отдельно выделенных рабочих зон в составе других функциональных помещений:
приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала (Рабочая зона 1);
выделения нуклеиновых кислот (Рабочая зона 2 или «чистая» зона);
проведения реакции амплификации (Рабочая зона 3);
учета результатов реакции амплификации нуклеиновых кислот методом электрофореза (Рабочая зона 4-1);
учета результатов (детекции) продуктов амплификации нуклеиновых кислот методом секвенирования и (или) на ДНК-чипах (Рабочая зона 4-2)
http://www.dna-technology.ru/files/images/metodichki/OsnoviPCR.pdf

Каждый цикл ПЦР включает 3 этапа:

3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
Денатурация I
Отжиг с праймерами I
Элонгация I
Денатурация II
Отжиг с праймерами II
Элонгация II
Итог II цикла

с каждым циклом ПЦР количество ампликонов увеличивается экспоненциально (приближается к зависимости 2n, где n — число циклов). За 30-40 циклов амплификации в растворе накапливается ≈ 108 молекул ампликона
выход всех других продуктов реакции увеличивается по линейной зависимости

Разновидности ПЦР
RT-PCR (Reverse Transcription PCR, ПЦР с обратной транскрипцией). Для изучения экспрессии генов. РНК → ДНК → ПЦР
Ассиметричная ПЦР (Аssimetric PCR) – для амплификации преимущественно одной цепи; используют разные количества праймеров
ПЦР длинных фрагментов (Long-range PCR) для амплификации фрагментов более 10 т.п.н. Используют две полимеразы (Taq и Pfu)
«Вложенная» ПЦР, гнездовая (Nested PCR) – c использованием второй пары праймеров, с помощью которой амплифицируется фрагмент полученного ранее ампликона

идентифицируемая
последовательность
первая пара праймеров
вторая пара праймеров
Первый раунд ПЦР
Второй раунд ПЦР

Разновидности ПЦР
Нot start PCR (ПЦР с «горячего старта»). В одном из вариантов метода сначала ДНК-полимеразу и реакционную смесь разделяют легкоплавким физическим барьером (напр., воском); → при нагревании пробирки переход ДНК-полимеразы в реакционную смесь происходит при температуре около 55 °С. Позволяет избежать удлинения неспецифически севших праймеров, повышает специфичность реакции
Multiplex PCR – при использовании нескольких пар праймеров одновременная амплификация нескольких фрагментов
Количественная ПЦР в реальном времени (Quantitative real-time PCR) c использованием флуоресцентно меченых атомов, позволяющая отслеживать количество наработанного продукта в каждом цикле ПЦР в реальном времени

Разновидности ПЦР
ПЦР с аллель-специфическими праймерами – позволяет находить небольшое число мутантных ДНК на фоне большого числа молекул дикого типа. Для детекции мутантной ДНК используют АС-праймеры, полностью комплементарные только мутантным последовательностям, что обеспечивает амплификацию только мутантной ДНК, а ДНК дикого типа в реакцию не вступает. Возможно обнаружение нескольких десятков или сотен молекул мутантной ДНК на фоне десятков тысяч молекул ДНК дикого типа .
http://humbio.ru/humbio/genexp/001b2a1f.htm

Real-Time PCR
Real-Time PCR (ПЦР-РВ) позволяет детектировать продукты ПЦР непосредственно в ходе амплификации через стенки или крышку закрытой пробирки
два основных подхода к детекции результатов:
с помощью интеркалирующих красителей - низкоспецифичный
на основе флуоресцентно-меченых олигонуклеотидных зондов – высокоспецифичный
Низкоспецифичная детекция продуктов амплификации за счет увеличения флуоресценции интеркалирующего красителя при образовании комплекса с двуцепочечной ДНК. Самый популярный краситель - SYBR Green I (чувствительный флуоресцентный индикатор двухцепочечной ДНК). Но: любая двуцепочечная ДНК!!! Вероятность регистрации ложноположительного результата

высокоспецифичная детекция: используется флуоресцентный зонд – олигонуклеотид, комплементарный внутренней последовательности амплифицируемого фрагмента + флуоресцентная молекула и молекула-«гаситель». Из-за близости последних энергия переходит на «гаситель» по принципу флуоресцентно-резонансного переноса энергии
в силу близости флуорофора и «гасителя» энергия, поглощенная флуорофором, переходит на «гасителя»; при этом сигнал флуоресценции отсутствует
флуорофор
гаситель

5’
3’
Taq-полимераза
праймер
матрица
зонд
В процессе синтеза новой цепи Taq-полимераза расщепляет зонд. Расстояние между флуорофором и «гасителем» увеличивается → тушение флуоресценции невозможно. Появляется сигнал.

Преимущества ПЦР «в реальном времени»
слияние во времени процесса амплификации и детекции результатов
снижение риска контаминации при оценке результатов
автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов
возможность оценки кинетики процесса
высокая специфичность реакции
воможность количественной оценки исходной ДНК-матрицы
упрощение требований к организации ПЦР-лаборатории (не требуется другого оборудования для детекции результатов ПЦР)
регистрация и учет данных в электронном формате и т.д

http://www.ld.ru/PCR/ilist-4314.html

ПЦР в модификации FLASH
Метод ПЦР с детекцией по "конечной точке" (FLASH - Fluorescent Amplification-based Specific Hybridization) также:
позволяет учитывать результаты ПЦР не открывая пробирки, непосредственно после проведения ПЦР, что блокирует возможность загрязнения ПЦР-лаборатории ампликонами
исключает стадии анализа продуктов ПЦР методом электрофореза
Но: регистрация флуоресценции при FLASH-детекции происходит по "конечной точке" - "end-point detection" на детекторе флуоресценции, который регистрирует флуоресцентное свечение реакционной смеси в пробирках непосредственно после проведения ПЦР.
http://www.ld.ru/PCR/flash-pcr.html
http://www.helicon.ru/catalog/detail.php?IBLOCK_ID=4&SECTION
_ID=22&ELEMENT_ID=1820

Другие способы детекции результатов ПЦР
с использованием метода гель-электрофорез
гели: агарозный (0,7-2%) и полиакриламидный (ПААГ. 10%)
агарозный гель позволяет идентифицировать фрагменты до 2 т.п.н. (2 т.н.) и более
ПААГ используют для детекции фрагментов 500 п.н. и меньше

ГЕЛЬ - ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
Агарозный гель, бромистый этидий
ДНК – продукт ПЦР
лунки

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
1-8 треки – положительный результат ПЦР
9-10 треки – отрицательный результат ПЦР
11 трек – контроль (фрагментированная ДНК плазмиды рUC19)
Окраска солями серебра

Полиакриламидный гель, окраска солями серебра
Фрагментированная ДНК плазмиды

ПЦР: правила «хорошего тона»
«списаны» у Н.С.Мюге
Всегда ставить отрицательный контроль (вода вместо ДНК)
Ставить положительный контроль (с заведомо работающей ДНК)
ПЦР-гигиена - не допускать попадания ПЦР-продукта в зону, где собирается реакция
Иметь «свой» набор реактивов и праймеров, пипетки должны быть четко маркированы (до и после ПЦР разные комплекты)
ПЦР продукты хранятся в отдельном холодильнике, и берутся другим комплектом рук