Трансгенез. Перспективы технологии клонирования (перенос ядра соматической клетки) в медицине

Трансгенез

Всё началось с селекции…

Селекция имеет свои ограничения

Ген (часто cDNA)
ATG
STOP
Промотор
Сигнал полиаденилирования Poly(A)/
Отвечает за стабильность транскрипта
Из чего состоит трансген?
минимальная комплектация

ген
ATG
STOP
Tag
«Энхансер»/
Регуляторные
елементы
промотор
Poly(A)
Из чего состоит трансген?
стандартная комплектация
инсуляторы
В случае необходимомти выделения и очистки белкового продукта

Из чего состоит трансген?
Комплектация люкс

Gene Delivery into Mammalian Cells:
Biological methods
Recombinant Viruses
Mechanical Methods
Microinjection
Particle Bombardment
Single-Walled Carbon Nanotubes
Physical Methods
Electroporation Techniques
Laser-Beam-Mediated DNA Delivery
Chemical Methods
Calcium phosphate method
Liposomes
Polymers polyethylenimines (PEIs)

DNA electroporation

SEM images of the calcium phosphate nanoparticles: (A) CaP–PEI–DNA–SiO2–SH; (B) CaP–DNA–CaP–PEI; (C) CaP–PEI–FITC

Пронуклеарная микроинъекция
Эффективность 1-5 %
Лентивирусная инфекция
Эффективность до 90 %,
Но часто много интеграций, причем в активные гены. В следующем поколении часто трансген
инактивируется
Сперматозоид в качестве вектора доставки
Эффективность около 1-5 %

Толщина волоса

Пронуклеарная микроинъекция приводит к встройке тандемного повтора из трансгенов в непредсказуемый локус генома

Клонирование
В качестве доноров ядер используется культура трансгенных клеток
Эффективность трансгенеза – 100%!
(все родившиеся животные будут трансгенными)

Искусственному отбору тысячи лет, почему первое трансгенное животное появилось только в 1974?

Использование ЭС клеток в трансгенезе
ЭС клетки
Селекция на устойчивость к антибиотику
GFP
neoR

суррогатная мать
химера норма
химера норма
Гетерозигота по трансгену норма норма
Использование ЭС клеток в трансгенезе

Генный нокаут (knockout)
это метод молекулярной генетики, позволяющий удалить полностью или сделать неработоспособными определенные гены.

Генный нокаут (knockout)
принципиальная схема
ЭС клетки
Селекция на устойчивость к антибиотику
Гомологичная рекомбинация

Генный нокаут (knockout)
суррогатная мать
химера норма
химера норма
Гетерозигота по нокауту норма норма

Почему чужеродная ДНК вообще встраивается в геном?

Два основных пути репарации двухцепочечных разрывов ДНК у эукариот
Негомологичное соединение концов
Гомологичная рекомбинация

Два основных пути репарации двухцепочечных разрывов ДНК у эукариот
Негомологичное соединение концов
Гомологичная рекомбинация
vs
конкуренция за связывание с разрывом
белков системы «Негомологичного соединения концов» в клетке больше, поэтому они чаще выигрывают эту битву. В итоге на одно событие гомологичной рекомбинации приходится 1000 - 10000 событий «Негомологичного соединения концов». Увы.

VS

Генный нокаут (knockout)
реальная схема
Гомологичная рекомбинация
Системы положительной селекции по резистентности к антибиотику не достаточно

Генный нокаут (knockout)
реальная схема
TK
- ген тимидин киназы вируса герпеса

Случайная инсерция
трансгена
+ Селекция на устойчивость к антибиотику
Knockout ЭС клетки
neor
TK
ЭС клетки
target
- Селекция на устойчивость к ганцикловиру
Не рекомбинантные клетки
Knockout клетки

Gene targeting
применение
Гуманизация мышей с целью получения человеческих антител в будущем может спасти миллионы жизней!

Гранулоцит-колониестимулирующий фактор
Granulozyten-Kolonie stimulierende Faktor

Nephila clavipes

Антитромбин ATryn

1 коза = 90000 доноров
ATryn

Очень сильно гиликозилирован примерно 26% массы приходится на сахара
C1-ингибитор системы комплемента
Недостаток приводит к развитию наследственного ангионевротического отёка
This disorder affects approximately one in 10,000–50,000 people

Таблица 1. Перечень белков, получаемых из молока трансгенных животных, отобранных для создания терапевтических препаратов (Niemann and Kues, 2007; Kues and Niemann, 2011)

Зелёная мясная муха (Lucilia sericata)

Активность генов тонко контролируется удаленными энхансерами

PEPCK-Cmus mice were created by introducing the cDNA for the enzyme (phosphoenolpyruvate carboxykinase), linked to the human α-skeletal actin gene promoter

INK-ATTAC, a transgenic mouse model that expresses the FK506-bindingprotein–caspase 8 (FKBP–Casp8) fusion protein and green fluorescent protein (GFP) under the control of a minimal Ink4a (also known as Ink4a/Arf or Cdkn2a) promoter fragment transcriptionally active in senescent cells. Upon administration of AP20187 (AP), a dimerizer that activates FKBP-fused Casp8 (ref. 4).

Трансгенный лосось
рыбы в возрасте 18 месяцев
рыбы в возрасте 36 месяцев

Американская бельдюга
Чавыча
ген гомона роста
промотор гена антифриз-белка
Где взять нужные гены?

Трансгенный лосось
одной рыбы хватить на целый месяц…
если сможете его поймать!

Гормон роста
+

ген антифриз-белка
антифриз-белок
Как генная инженерия помогла в производстве некаллорийного мороженого

Трансгенез в медицине:
производство гормонов
Гипофизарная карликовость
Соматотропин
Раньше:
источник – трупный материал
4-6 мг из одного трупа
препарата не хватало на всех
мог содержать вирусы
Сейчас:
Все проблемы решены☺
Инсулин
Раньше:
источник поджелудочная железа коровы или свиньи
100г инсулина из 1т поджелудочной железы
Сейчас:
из 1000 л культуральной среды 200 г гормона

Стратегии активного трансгенеза
CRE/loxP система интеграции фага P1

Схема loxP сайта
ATAACTTCGTATA
TATACGAAGTTAT
GCATACAT
34 bp: 8-bp последовательность фланкирована
13-bp инверитрованными повторами

Q Zhou et al. Nature 000, 1-6 (2008) doi:10.1038/nature07314
Induced new b-cells originate from differentiated exocrine cells.

Транспозон спящая красавица (Sleeping Beauty)
не оставляет «следов»

Frog Prince transposon system
Sleeping Beauty transposon system
Транспозон леопардовой лягушки
Rana pipiens

Brainbow мыши

Из чего состоит трансген?
Комплектация люкс

Трехмерная реконструкция отдельных клеток

Картина Джексона Полока, авангардный экспрессионизм

Крипты тонкого кишечника
у мышей, несущих конструкцию конфети

Ворсинки тонкого кишечника
у мышей, несущих конструкцию конфети

CLARITY (Clear, Lipid-exchanged, Anatomically Rigid, Imaging/immunostaining compatible, Tissue hYdrogel)

Organic vs GMO

Вспышка пищевых отравлений в Европе в 2011 году
Пострадало 3950 человек
53 человека погибли у 800 диагностирован гоемолитический уремический синдром, вплоть до отказа почек

Пажитник