Цитогенетический и молекулярно-генетический методы

1.1 Цитогенетические методы
С помощью данного метода можно изучать наследственный материал клетки: совокупность хромосом в целом (кариотипирование) или наличие и количество Х-хромосом (определение полового хроматина — число глыбок полового хроматина или телец Барра). Исследование проводится с помощью светового микроскопа (изготовление и изучение микропрепаратов).

Кариотипирование
Кариоти́п — совокупность признаков (число, размеры, форма и т. д.) полного набора хромосом, присущая клеткам данного биологического вида (видовой кариотип), данного организма (индивидуальный кариотип) или линии (клона) клеток. Графическое изображение кариотипа, то есть, набора хромосом при расположении их по группам в зависимости от формы и величины, называют — идиограмма (кариограмма).

Определение кариотипа
Для определения кариотипа используются клетки в одной из стадий их деления — метафазе митоза.
После фиксации препараты метафазных хромосом окрашивают и фотографируют; из микрофотографий формируют так называемый систематизи-рованный кариотип.

Классический и спектральный кариотипы
Для получения классического кариотипа используется окраска хромосом различными красителями или их смесями: в силу различий в связывании красителя с различными участками хромосом окрашивание происходит неравномерно и образуется характерная полосчатая структура.
Первый метод окраски хромосом, позволяющий получить такие высокодетализированные изображения, был разработан шведским цитологом Касперссоном (Q-окрашивание).

Q-окрашивание
Окрашивание по Касперссону акрихин-ипритом с исследованием под флуоресцентным микроскопом. Хромосомы окрашиваются в виде специфических наборов светлых и темных полос (Q-полосы). Чаще всего применяется для исследования Y-хромосом.

G-окрашивание
Модифицированное окрашивание по Романовскому — Гимзе. Чувствительность выше, чем у Q-окрашивания, поэтому используется как стандартный метод цитогенетического анализа. Применяется при выявлении небольших аберраций и маркерных хромосом (сегментированных иначе, чем нормальные гомологичные хромосомы).

R-окрашивание
Используется акридиновый оранжевый и подобные красители, при этом окрашиваются участки хромосом, нечувствительные к G-окрашиванию. Используется для выявления деталей гомологичных G- или Q-негативных участков сестринских хроматид или гомологичных хромосом.

С-окрашивание
Применяется для анализа центромерных районов хромосом, содержащих конститутивный гетерохроматин и вариабельной дистальной части Y-хромосомы. Гетерохроматин — тип хроматина, который всегда остается в конденсированном состоянии и окрашивается в интерфазных клетках.

Т-окрашивание
Применяют для анализа теломерных районов хромосом.

Ломкие участки — неокрашиваемые промежутки, иногда наблюдаемые в характерных местах в различных хромосомах.
Известно множество наследуемых вариантов ломких участков. Наиболее очевидно клиническое значение ломких участков на длинном плече Х-хромосомы у мальчиков с часто встречающейся специфической формой сцепленной с полом умственной отсталости, а также у некоторых женщин — носителей этого генетического дефекта.
Обнаружение ломкого участка в Х-хромосоме — диагностическая процедура, специфичная для синдрома ломкой Х-хромосомы, хотя в большинстве лабораторий этот тест заменен или дополнен молекулярным тестированием для обнаружения экспансии тринуклеотидного повтора CGG в гене этого заболевания FMR1.

Флуоресцентная гибридизация
Состоит в окрашивании хромосом набором флуоресцентных красителей, связывающихся со специфическими областями хромосом. В результате такого окрашивания гомологичные пары хромосом приобретают идентичные спектральные характ-еристики, что не только существенно облегчает выявление таких пар, но и облегчает обнаружение межхромосомных транслокаций.

Преимущества гибридизации:
Способность обнаружить микроделеции
Исследуются не только метафазные клетки, но и интерфазное ядро
Выявление злокачественных онкозаболеваний
Используют в пренатальной и преимплантационной диагностике.

Идентификация хромосом
По положению центромеры:
Метацентрические хромосомы
Акроцентрические хромосомы
Субметацентрические хромосомы
Потенциальный четвертый тип хромосом, телоцентрический, с центромерой на одном конце и единственным плечом, не представлен в нормальном кариотипе человека.

Определение полового хроматина
У женщин (46, XX) одна Х-хромосома является активной, а другая Х-хромосома находится в неактивном, спирализованном состоянии.
половой Х-хроматин в норме выявляется только у женщин и отсутствует у мужчин.

1.2 Молекулярно-генетические методы
Выделение ДНК
Подготовка биоматериала
Исследование небольшого фрагмента ДНК
Амплификация ДНК методом ПЦР (денатурация, гибридизация, полимеризация)

ПЦР включает три стадии:
1. Денатурацию - процесс разъединения двойной спирали на комплементарные одноцепочечные нити (первая стадия ПЦР).
2. гибридизацию - образование двойных цепей ДНК, или копирование одноцепочечных молекул ДНК. Реакция протекает в течение 30 с при снижении температуры с 90 ºC до 50 ºC при участии фермента термостабильной ДНК-полимеразы.
3. Полимеризацию - третья стадия цикла ПЦР, в ходе которой при увеличении температуры с 50 ºC до 72 ºC ДНК-полимераза присоединяется к 3’- концам праймеров и удлиняет оба праймера с их 3’- концов до размеров матричной нити ДНК. Разрезание ДНК на фрагменты осуществляемое рестриктазами, и получение набора фрагментов длиной в 4–6 нуклеотидов. Деление ДНК на части необходимо, так как проводить анализы с огромными молекулами ДНК невозможно.

1.3. Биохимические методы
Биохимические методы позволяют диагностировать наследственно обусловленное нарушение обмена веществ. Многие наследственные заболевания обмена веществ – генные мутации связаны с ферментопатиями. Материалом биохимической диагностики являются: моча, кровь, культуры клеток фибробластов и лимфоцитов.