Установление первичной структуры нуклеиновых кислот (секвенирование)

План лекции
Секвенирование первого поколения (Сэнгера, Максама-Гилберта)
Секвенирование второго поколения (Illumina, Roche, Applied Biosystems, Ion Torrent)
Секвенирование третьего поколения (Oxford Nanopore, Pacific Biosciences)

Секвенирование первого поколения
1977 г
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC431765/
Декабрь
https://www.pnas.org/content/pnas/74/2/560.full.pdf
Февраль

Метод Максама-Гилберта
CTCAAAAGTCTAGAGCCACCGTCCAGGGAGCAGGTAGCTGCTGGGCTCCGGGGACACTTTGCGTTCGGGC
P*O4CTCAAAAGTCTAGAGCCACCGTCCAGGGAGCAGGTAGCTGCTGGGCTCCGGGGACACTTTGCGTTCGGGC
P*O4CTCAAAAGTCTAGAGCCACCGTCCAGGGAGCAGGTAGCTGCTGGGCTCCGGGGACACTTTGCGTTCGGGC

Метод Максама-Гилберта
A+G
G
T+C
C
P*O4CTCAAAAGTCTAGAGCCACCGTCCAGGGAGCAGGTAGCTGCTGGGCTCCGGGGACACTTTGCGTTCGGGC
и т.д.

Метод Максама-Гилберта (1980 г.)
Удалить немеченный фосфат с 5’-конца молекулы с помощью фосфатазы (она же – фосфомоноэстераза)
Ввести меченный фосфат на 5’-конец с помощью полинуклеотидкиназы и АТФ с меченным γ-фосфатом
В четырех разных реакциях (для G, для A+G, для T+C и для C) провести расщепление одной фосфодиэфирной связи на каждую молекулу по одному случайному соответствующему нуклеотиду
С помощью электрофореза в полиакриламидном геле разделить получившиеся фрагменты

Метод Максама-Гилберта (1980 г.)
Удалить немеченный фосфат с 5’-конца молекулы с помощью фосфатазы (она же – фосфомоноэстераза)

Метод Максама-Гилберта (1980 г.)
Ввести меченный фосфат на 5’-конец с помощью полинуклеотидкиназы и АТФ с меченным γ-фосфатом

Метод Максама-Гилберта (1980 г.)
В четырех разных реакциях (для G, для A+G, для T+C и для C) провести расщепление одной фосфодиэфирной связи на каждую молекулу по одному случайному соответствующему нуклеотиду
Разрезаем после:
G
A и G
T и C
C

Метод Максама-Гилберта (1980 г.)
P*O4CTCAAAAGTCTAGAGCCACCGTCCAGGGAGCAGGTAGCTGCTGGGCTCCGGGGACACTTTGCGTTCGGGC
P*O4
P*O4CT
P*O4CTCAAAAGT
P*O4CTCAAAAGTCTAGAG
P*O4CTCAAAAGTCTAGAGC
P*O4CTCAAAAGTCTAGAGCCA
P*O4CTCAAAAGTCTAGAGCCAC
P*O4CTCAAAAGTCTAGAGCCACCGT
P*O4CTCAAAAGTCTAGAGCCACCGTC
P*O4CTCAAAAGTCTAGAGCCACCGTCCAGGGAG
P*O4CTCAAAAGTCTAGAGCCACCGTCCAGGGAGCA
P*O4CTCAAAAGTCTAGAGCCACCGTCCAGGGAGCAGGTAG
P*O4CTCAAAAGTCTAGAGCCACCGTCCAGGGAGCAGGTAGCTG и т.д.
разрезаем после C

Метод Максама-Гилберта (1980 г.)
Как разрезать фосфодиэфирную связь по гуанозину (G):

Метод Максама-Гилберта (1980 г.)
Как разрезать фосфодиэфирную связь по аденозинам и гуанозинам (A+G):

Метод Максама-Гилберта (1980 г.)
Как разрезать фосфодиэфирную связь по цитидинам и тимидинам (C+T):
В щелочных условиях (0,1 М KOH) или при высокой соли (1 М NaCl) реакция проходит только для дезоксицитидинов

Метод Максама-Гилберта (1980 г.)
В четырех разных реакциях (для G, для A+G, для T+C и для C) провести расщепление одной фосфодиэфирной связи на каждую молекулу по одному случайному соответствующему нуклеотиду
Разрезаем после:
G (ДМС)
A и G (HCOOH)
T и C (NH2NH2)
C (NH2NH2 1M NaCl

Метод Максама-Гилберта

Метод Максама-Гилберта (1980 г.)
P*O4CTCAAAAGTCTAGAGCCACCGTCCAGGGAGCAGGTAGCTGCTGGGCTCCGGGGACACTTTGCGTTCGGGC
P*O4
P*O4CT
P*O4CTCAAAAGT
P*O4CTCAAAAGTCTAGAG
P*O4CTCAAAAGTCTAGAGC
P*O4CTCAAAAGTCTAGAGCCA
P*O4CTCAAAAGTCTAGAGCCAC и т.д.
по C
P*O4CTCAAAA
P*O4CTCAAAAGTCTA
P*O4CTCAAAAGTCTAGA
P*O4CTCAAAAGTCTAGAGCCACC
P*O4CTCAAAAGTCTAGAGCCACCGTCCA
P*O4CTCAAAAGTCTAGAGCCACCGTCCAG
P*O4CTCAAAAGTCTAGAGCCACCGTCCAGGGA и т.д.
по G
P*O4CTC
P*O4CTCA
P*O4CTCAA
P*O4CTCAAA
P*O4CTCAAAAGTCT
P*O4CTCAAAAGTCTAG
P*O4CTCAAAAGTCTAGAGCC и т.д.
по A+G
P*O4C
P*O4CTCAAAAG
P*O4CTCAAAAGTC
P*O4CTCAAAAGTCTAGAGCCACCG и т.д.
по T+C
Электрофорез в ПААГ

Метод Максама-Гилберта
P*O4CTCAAAAGTCTAGAGCCACCGTCCAGGGAGCAGGTAGCTGCTGGGCTCCGGGGACACTTTGCGTTCGGGC
A+G
G
T+C
C
и т.д.

Метод Сэнгера
3’-CTCAAAAGTCTAGAGCCACCGTCCAGGGAGCAGGTAGCTGCTGGGCTCCGGGGACACTTTGCGTTCGGGC -5’
5’-GAGTTTTCAGATCTCGGT-3’-OH
||||||||||||||||||
+ фрагмент Клёнова
+ dATP + dTTP + dCTP + dGTP
+ddATP*
+ddTTP*
+ddCTP*
+ddGTP*
GAGTTTTCAGATCTCGGTGGCA-H
GAGTTTTCAGATCTCGGTGGCAGGTCCCTCGTCCA-H
GAGTTTTCAGATCTCGGTGGCAGGTCCCTCGTCCATCGA-H
и т.д.
GAGTTTTCAGATCTCGGTGGCAGGT-H
GAGTTTTCAGATCTCGGTGGCAGGTCCCT-H
и т.д.
GAGTTTTCAGATCTCGGTGGC-H
GAGTTTTCAGATCTCGGTGGCAGGTC-H
и т.д.
GAGTTTTCAGATCTCGGTG-H
GAGTTTTCAGATCTCGGTGG-H
GAGTTTTCAGATCTCGGTGGCAG-H
и т.д.
Электрофорез в ПААГ

A
G
T
C
GAGTTTTCAGATCTCGGTGGCAGGTCCCTCGTCCATCGACGACCCGAGGCCCCTGTGAAACGCAAGCCCG
и т.д.
Метод Сэнгера
Максама-Гилберта
Сэнгер
A+G
G
T+C
C
и т.д.

Метод Сэнгера vs Максама-Гилберта
- Требует большого количества исходного материала
- Требует знания о районе для праймера
+ Нет высокотоксичных соединений
+ Возможность автоматизации
+ Возможно секвенирование сразу после выделения ДНК
+ Можно секвенировать любую последовательность
- ДМС и гидразин – сильные канцерогены
- Трудно автоматизировать

Метод Сэнгера. Усовершенствования
Радиоактивное мечение заменено на флуорофоры
Каждый из типов нуклеотидов мечен отдельным флуорофором
Разделение фрагментов и обработка результатов электрофореза проводятся автоматически на приборе

Секвенирования второго (следующего) поколения – Next generation sequencing
Появление ПЦР в 1985 году
Появление термостабильной ДНК-полимеразы в 1986 году
Развитие микрочиповых исследований с 1995 года
Крупные вложения в технологии секвенирования в процессе секвенирования генома человека в начале 2000-х

Отличия NGS от «обычного» секвенирования
Не требуется проведение электрофореза
Чтение нуклеотидов осуществляется в процессе секвенирования
Секвенируются одновременно сотни тысяч, миллионы или миллиарды последовательностей (против 8–96 в реакции Сэнгера)
Реакции секвенирования проходят на поверхности или в лунках

Варианты подходов в NGS (второе поколение)
Синтез
ДНК-полимераза
Лигирование
Лигаза
(SOLiD)
Меченные нуклеотиды
(Illumina)
Детекция пирофосфата
(Roche)
Изменение pH
(Ion Torrent)

Варианты подходов в NGS (второе поколение): технология Illumina (Solexa)

Варианты подходов в NGS (второе поколение): технология Illumina (Solexa)
Красным – терминирующая группа. Могут быть 3’-блокирующие (слева) и 3’-неблокирующие (справа)
Синее – неудаляемый заместитель

5’
3’
5’
3’
Этап 1 – Добавление меченных дНТФ

5’
3’
5’
3’
Этап 2 – Образование фосфодиэфирных связей

Этап 3 – Отмывание от несвязавшихся нуклеотидов и считывание сигнала
5’
3’
5’
3’

Этап 4 – Удаление терминирующей группы
5’
3’
5’
3’

Варианты подходов в NGS (второе поколение): технология 454 (Roche)
Каждый нуклеотид добавляется поочередно, и в каждой точке проверяется, выделился ли пирофосфат
?

Варианты подходов в NGS (второе поколение): технология 454 (Roche)
Каждый нуклеотид добавляется поочередно, и в каждой точке проверяется, выделился ли пирофосфат
?

Варианты подходов в NGS (второе поколение): технология 454 (Roche)
Каждый нуклеотид добавляется поочередно, и в каждой точке проверяется, выделился ли пирофосфат
?

Варианты подходов в NGS (второе поколение): технология 454 (Roche)
Каждый нуклеотид добавляется поочередно, и в каждой точке проверяется, выделился ли пирофосфат
?

Варианты подходов в NGS (второе поколение): технология Ion Torrent (ThermoFisher)
Каждый нуклеотид добавляется поочередно, и в каждой точке проверяется, изменился ли pH
?

Варианты подходов в NGS (второе поколение): технология Ion Torrent (ThermoFisher)
?
Каждый нуклеотид добавляется поочередно, и в каждой точке проверяется, изменился ли pH

Варианты подходов в NGS (второе поколение): технология Ion Torrent (ThermoFisher)
?
Каждый нуклеотид добавляется поочередно, и в каждой точке проверяется, изменился ли pH

Варианты подходов в NGS (второе поколение): технология Ion Torrent (ThermoFisher)
Каждый нуклеотид добавляется поочередно, и в каждой точке проверяется, изменился ли pH
https://www.pnas.org/content/103/17/6466.abstract?ck=nck

Варианты подходов в NGS (второе поколение): основная проблема пиросеквенирования и Ion Torrent (ThermoFisher)
3’-CTCAAAAGTCTAGAGCCACCGTCCAGGGAGCAGGTAGCTGCTGGGCTCCGGGGACACTTTGCGTTCGGGC -5’
5’-GAGTTTTCAGATCTCGGT-3’-OH
||||||||||||||||||
Добавляем
A

Варианты подходов в NGS (второе поколение): основная проблема пиросеквенирования и Ion Torrent (ThermoFisher)
3’-CTCAAAAGTCTAGAGCCACCGTCCAGGGAGCAGGTAGCTGCTGGGCTCCGGGGACACTTTGCGTTCGGGC -5’
5’-GAGTTTTCAGATCTCGGT-3’-OH
||||||||||||||||||
Добавляем
T

Варианты подходов в NGS (второе поколение): основная проблема пиросеквенирования и Ion Torrent (ThermoFisher)
3’-CTCAAAAGTCTAGAGCCACCGTCCAGGGAGCAGGTAGCTGCTGGGCTCCGGGGACACTTTGCGTTCGGGC -5’
5’-GAGTTTTCAGATCTCGGT-3’-OH
||||||||||||||||||
Добавляем
G
3’-CTCAAAAGTCTAGAGCCACCGTCCAGGGAGCAGGTAGCTGCTGGGCTCCGGGGACACTTTGCGTTCGGGC -5’
5’-GAGTTTTCAGATCTCGGTGG-3’
||||||||||||||||||||
0
1
2

Варианты подходов в NGS (второе поколение): основная проблема пиросеквенирования и Ion Torrent (ThermoFisher)
3’-CTCAAAAGTCTAGAGCCACCGTCCAGGGAGCAGGTAGCTGCTGGGCTCCGGGGACACTTTGCGTTCGGGC -5’
5’-GAGTTTTCAGATCTCGGTGG-3’-OH
||||||||||||||||||||
Добавляем
C
3’-CTCAAAAGTCTAGAGCCACCGTCCAGGGAGCAGGTAGCTGCTGGGCTCCGGGGACACTTTGCGTTCGGGC -5’
5’-GAGTTTTCAGATCTCGGTGGC-3’
|||||||||||||||||||||
0
1
2

Варианты подходов в NGS (второе поколение): основная проблема пиросеквенирования и Ion Torrent (ThermoFisher)
3’-CTCAAAAGTCTAGAGCCACCGTCCAGGGAGCAGGTAGCTGCTGGGCTCCGGGGACACTTTGCGTTCGGGC -5’
5’-GAGTTTTCAGATCTCGGTGGC-3’-OH
|||||||||||||||||||||
Добавляем
A
3’-CTCAAAAGTCTAGAGCCACCGTCCAGGGAGCAGGTAGCTGCTGGGCTCCGGGGACACTTTGCGTTCGGGC -5’
5’-GAGTTTTCAGATCTCGGTGGCA-3’
||||||||||||||||||||||
0
1
2

Варианты подходов в NGS (второе поколение)
Синтез
ДНК-полимераза
Лигирование
Лигаза
(SOLiD)
Меченные нуклеотиды
(Illumina)
Детекция пирофосфата
(Roche)
Изменение pH
(Ion Torrent)
Высокая точность (>99,99%)
~10 ч
7–542 $/Gb
Низкая точность (~99,5%)
~10 ч
~ 12560 $/Gb
Низкая точность (~99,5%)
~2,5 ч
4,3–50 $/Gb

Варианты подходов в NGS (третье поколение)
Не требует фрагментации исследуемой молекулы, то есть выделенная ДНК (или даже РНК!) почти сразу загружается в прибор
Ну очень длинные прочтения (до 1 миллиона п.о.)
Проходит в режиме реального времени (нет остановки на добавление новых нуклеотидов)
Множество ошибок в определенных нуклеотидах (точность 85–95 %)

Варианты подходов в NGS (третье поколение)
Oxford Nanopore
MinION
Pacific Biosciences
Sequel
Прибор – 1000 $
Запуск 500–900 $
Основан на поре с геликазой
Прибор – 350’000 $
Запуск – 850 $
Основан на ДНК-полимеразе и конфокальной микроскопии

Варианты подходов в NGS (третье поколение): PacBio
В каждой лунке закреплена молекула ДНК-полимеразы
Снизу в лунку поступает свет
Считывание сигнала происходит только около полимеразы
К γ-фосфату каждого нуклеотида пришит свой флуорофор
Время присоединения нуклеотида – мс, время диффузии остальных нуклеотидов - мкс