Множественные выравнивания

Что такое множественное выравнивание?
Несколько гомологичных последовательностей, написанных друг под другом оптимальным способом:
Гомологичные остатки один под другим
Остатки в одинаковом пространственном положении один под другим
Остатки, имеющие одинаковую функциональную нагрузку, один под другим
Одинаковые или похожие остатки один под другим

Какое выравнивание интереснее?

Какие бывают выравнивания?
локальные
глобальные
локальные
глобальные
множественные
парные
Выравнивания

Зачем нужно множественное выравнивание?
Перенос аннотации
Предсказание функции каждого остатка (например, выявление остатков, составляющих активный центр фермента)
Моделирование 3D – структуры
Реконструкция эволюционной истории последовательности (филогения)
Выявление паттерна функциональных семейств и сигналов в ДНК
Построение доменных профайлов
Аккуратный дизайн праймеров для PCR анализа

Как выбрать последовательности для множественного выравнивания?
Выравнивайте белки, а не ДНК, если есть выбор
Последовательностей лучше много, но не слишком (~ 10-15)
В выборке лучше избегать:
слишком похожих последовательностей (>90% id)
слишком разных последовательностей (<30% id c большинством)
неполных последовательностей (фрагментов)
тандемных повторов

Изучая новую последовательность
Выборка на основе BLAST
Подробно охарактеризованные последовательности - аннотация
Совсем неохарактеризованные (hypothetical proteins) – достаточный уровень разнообразия
Выравнивание по всей длине
e-value – 10 -40 – 10 -6
Избегать partial sequences

Подготовка выборки
BLAST => сохранить все последовательности разом в FASTA формате или сразу на выравнивание
Имена последовательностей:
не более 15 символов
без пробелов
как можно меньше служебных символов – можно “_”
нельзя использовать одинаковых имен!

Как можно строить глобальное множественное выравнивание?
Построение множественного выравнивания N последовательностей
t =LN !!!
Можно пытаться строить точно также, как и парное – слева направо, максимизируя вес выравнивания по столбцам (алгоритм Нидельмана –Вунша)

Алгоритм ClustalW – пример эвристического прогрессивного алгоритма
Руководящее дерево
Очевидные недостатки:
Результат зависит от порядка выравниваний;
«один раз гэп – всегда гэп»

Современные методы построения множественного выравнивания
(MSA, multiple sequence alignment):
Алгоритм ClustalW (реализации ClustalX, emma из EMBOSS) – до сих пор самый популярный, но уже устаревший метод (на Web – например, http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html)
Muscle – быстрее и немного точнее, самый новый и довольно модный (http://phylogenomics.berkeley.edu/cgi-bin/muscle/input_muscle.py)
T-COFFEE – заметно точнее, но существенно медленнее
(http://www.igs.cnrs-mrs.fr/Tcoffee/tcoffee_cgi/index.cgi)

Использование ClustalW

Какие output-форматы бывают
Post-script, pdf, html – только графика
FASTA – последовательности отдельно, но с пробелами (PIR – аналогично)
MSF (ALN, Phylip, Selex …) – наглядно. Сверху – описание выборки: программа, название последовательностей, их длина, вес в выравнивании; потом само выравнивание блоками по 60 остатков

Перевод форматов: READSEQ
(http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/readseq/)
Аналогично: SEQCHECK

ClustalW - output

JalView – редактирование выравниваний
Другие программы для редактирования выравниваний (stand-alone):
GeneDoc; CINEMA; Seaview; Belvu; Bioedit; DCSE
Список - http://bioweb.pasteur.fr/cgi-bin/seqanal/review-edital.pl

TCoffee
Построение множественных выравниваний
Оценка достоверности существующего выравнивания
Использование 3-D структуры при построении выравнивания
Сравнение и комбинирование выравниваний

TCoffee
Выход – файлы clustalw_alnВыход – файлы clustalw_aln, fasta_alnВыход – файлы clustalw_aln, fasta_aln, phylipВыход – файлы clustalw_aln, fasta_aln, phylip, score_htmlВыход – файлы clustalw_aln, fasta_aln, phylip, score_html, score_pdf, dnd file

Как использовать TCoffee для других целей
Множественное выравнивание на основе 3D-структуры (Expresso): надо заменить 1 или более имен в FASTA формате последовательностей на PDB-идентификатор соответствующей структуры. Тест – “Template file” (число структур). Если не в PDB – “Advanced”
Alignment evaluation – готовое выравнивание на вход. На выходе – раскрашенное выравнивание (score.html, score.pdf): каждый столбец покрашен в соответствии с качеством – красный/оранжевый/желтый - хорошо

Как “читать” множественное выравнивание?
Хорошее выравнивание – высоко-консервативные блоки, перемежающиеся блоками с инсерциями/делециями
ДНК – консервативные “островки”
Качество – score, локально важно
“consensus” – строка с символами “*”, “:”, “.” – консервативный, похожие по размеру и гидропатичности, похожие по размеру ИЛИ гидропатичности, соответственно

Если консервативны только отдельные столбцы
W, Y, F – консервативное гидрофобное ядро, стабилизирующая роль в ядре. Если и мутируют, то между собой
G,P - фланкируют бета-стренды и альфа-спирали
С – участвует в образовании дисульфидных мостиков – одинаковое расстояние между
H,S – каталитические центры протеаз
K, R, D, E – заряженные аминокислоты, участвуют в связывании лигандов
L – редко консервативны. Формируют leucine zipper – белок-белковые взаимодействия

Локальное множественное выравнивание – постановка задачи
Ряд последовательностей, в каждой из которых есть интересное слово (либо точно, либо с небольшим количеством замен) известной длины
=> Найти и описать это слово
Идея. Будем искать перепредставленное слово. Стартуем со всех слов в выравнивании, ищем лучшее его представление в каждой из последовательностей и потом уточняем по полученному профайлу

dnaN ACATTATCCGTTAGGAGGATAAAAATG
gyrA GTGATACTTCAGGGAGGTTTTTTAATG
serS TCAATAAAAAAAGGAGTGTTTCGCATG
bofA CAAGCGAAGGAGATGAGAAGATTCATG
csfB GCTAACTGTACGGAGGTGGAGAAGATG
xpaC ATAGACACAGGAGTCGATTATCTCATG
metS ACATTCTGATTAGGAGGTTTCAAGATG
gcaD AAAAGGGATATTGGAGGCCAATAAATG
spoVC TATGTGACTAAGGGAGGATTCGCCATG
ftsH GCTTACTGTGGGAGGAGGTAAGGAATG
pabB AAAGAAAATAGAGGAATGATACAAATG
rplJ CAAGAATCTACAGGAGGTGTAACCATG
tufA AAAGCTCTTAAGGAGGATTTTAGAATG
rpsJ TGTAGGCGAAAAGGAGGGAAAATAATG
rpoA CGTTTTGAAGGAGGGTTTTAAGTAATG
rplM AGATCATTTAGGAGGGGAAATTCAATG
Cons tacataaaggaggtttaaaaat
Как это выглядит

Gibbs sampler
Let’s A be a signal (set of sites), and I(A) be its information content.
At each step a new site is selected in one sequence with probability
P ~ exp [(I(Anew)]
For each candidate site the total time of occupation is computed.
(Note that the signal changes all the time)

Соответствующие программы

Представление результатов таких программ – Logos
Программы построения –
http://www-lmmb.ncifcrf.gov/~toms/sequencelogo.html;
http://www.cbs.dtu.dk/~gorodkin/appl/plogo.html

Greedy algorithms (MEME)
Find a signal among all k-words (assuming that we know the length signal).
For all k-words it’s too time-consuming (k~16). So initially we consider only k-words that were present in the fragments.
For each k-word construct a matrix of “sites”: alignment of best “copies” of the k-word from every sequence fragment.
Select the best k-word. What is the measure for comparison of matrices? Information content!

Greedy algorithms. Cont’d
Select the k-word with maximal information content
Problem. We considered only k-words from our sequences => may select not the signal (the consensus word), but only its best representative in our sample
Solution. For each k-word from the sample construct PWM and reconstruct the frequency matrix based on it. Repeat until stabilization of the matrix. Use the consensus of this matrix.

Limitation of greedy algorithms
Started from k-words in our sequences and increase the information content at each step => find a local (not global) maximum of the functional.
We need an alternative algorithm that will not be “greedy”!