Анализ микробиоты кишечника и экспресс-диагностика острых кишечных инфекций методом ПЦР

Из каких микробов состоит кишечная флора?
Как определить ее состав?
Зачем это делать?
Три вопроса клинициста к микробиологу

Наименование микроорганизмов
Состав кишечной микрофлоры по ОСТ 91500.11.0004-2003

Состав кишечной микрофлоры по ОСТ 91500.11.0004-2003

Наиболее распространенные обитатели кишечника (Zoetendal E., 2006)

Состав микрофлоры взрослого человека (Европа)
Состав микрофлоры взрослого человека по ОСТ91500.11.0004-2003

Бактериологический посев
Микроскопия
Дыхательный тест
Генно- молекулярные методы
PCR/denaturing electrophoretic polyacrylamide gels (PCR/DGGE, PCR/TTGE)
Fluorescent in situ hybridization/fluorescence-activated cell sorting (FISH/FC)
16S rRNA филогения
Метагеномика
Мета транскриптомика
ПЦР в режиме реального времени
Методы определения микрофлоры кишечника

Анализируемые показатели

Преимущества и недостатки метода ПЦР в реальном времени:
+ эффективность в обнаружении анаэробных бактерий
+ быстрота выполнения (1-2 суток)
+ доступные условия транспортировки анализируемого материала до лаборатории (до двух дней в холодильнике)
- невозможность подбора противомикробных препаратов

Анализ микробиоценоза кишечника методом ПЦР в реальном времени
- Bacteroides fragilis
Этапы исследования:
Выделение бактериальной ДНК
Амплификация специфических участков бактериального генома и детекция флуоресцентного сигнала в реальном времени
Расчет количественного соотношения бактерий по величине порогового цикла (абсолютное количество и отношение к общему бактериальному числу)

Основные варианты дисбиотических нарушений, выявляемые методом ПЦР в реальном времени
1. значительное увеличение числа Bacteroides fragilis и соответственно изменение количественного соотношения Bacteroides fragilis/ Fecalibacterium prauznitzii.
Норма
Патология
(язвенный колит)
- Bacteroides fragilis (Сt=23)
- Fecalibacterium prauznitzii (Сt=25)
- Bacteroides fragilis (Сt=16)
- Fecalibacterium prauznitzii (Сt=28)

Выявление в диагностически значимых количествах (>10*4) представителей условно-патогенной флоры (Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumonia), в особенности штаммов, несущих гены патогенности
Изменение соотношения субпопуляций анаэробных бактерий, осуществляющих различные виды брожения (например, продуцентов бутирата и продуцентов пропионата)