Функции белков и генов

План
Что важно знать функции данного белка и где это найти?
Как найти все белки с определенной функцией?
Как бороться с синонимами?
База данных GO: структура; использование
Что такое “Protein evidence”?

Задача I: узнать функцию белка
Пример: что за белок Q71SG9_KLEPN
Название (кто?)
Uniprot:
Cytosine-specific methyltransferase
ген kpn2kIM
Откуда?
Klebsiella pneumoniae
плазмида

Q71SG9_KLEPN
Что делает?
Pubmed:
статей нет
ссылка на Gene DB (NCBI) (часть проекта RefSeq):
type II DNA-methyltransferase
Кто – ближайший изученный гомолог?
BLAST
MTS2_SHISO, Identity 100% по всей длине (!?)
M.SsoII, Shigella sonnei , плазмида

M.SsoII

M.SsoII
Что делает?
Pubmed:
есть статьи; нет обзоров
Uniprot ссылается на разные БД
GO:0003886 (F)
Molecular Function: Catalysis of the reaction: S-adenosyl-L-methionine + DNA containing cytosine = S-adenosyl-L-homocysteine + DNA containing 5-methylcytosine
Переносит метильную группу с кофактора на цитозин ДНК
приведен список из 20 синонимов

M.SsoII
Uniprot ссылается на разные БД (продолжение)
GO:0043565: (F)
Name: sequence-specific DNA binding
Molecular Function: Interacting selectively and non-covalently with DNA of a specific nucleotide composition, e.g. GC-rich DNA binding, or with a specific sequence motif or type of DNA e.g. promotor binding or rDNA binding.
EC 2.1.1.37
Catalysis of the reaction: S-adenosyl-L-methionine + DNA containing cytosine = S-adenosyl-L-homocysteine + DNA containing 5-methylcytosine
COMMENT * See the REBASE database for a complete list of these enzymes: http://rebase.neb.com/rebase/
приведен список из 20 синонимов

Мы описали
МОЛЕКУЛЯРНУЮ ФУНКЦИЮ
белка M.SsoII (и гомолога из K.pn.)

M.SsoII
Каков механизм работы?
кофактор SAM (S-adenosyl-L-methionine)
на какой атом ДНК переносится – углерод в 5-м положении цитозина
как фермент, кофактор и субстрат расположены в пространстве? 3D структуры нет; есть модель, построенная по гомологам доменов с известной структурой. Цитозин выворачивается, см. рис.
как устроен активный центр? – известны консервативные мотивы и остатки
как происходит узнавание последовательности ДНК? – известна узнаваемая последовательность – CCNGG - и домен, отвечающий за узнавание (TRD)
….
Методы:
Пришивка (cross-linking)
Мутагенез
…..
моделирование структуры
консервативность последовательностей ….
….. множество всего
Модель метилазного домена M.SsoII
Метилируемый цитозин
SAM

Описали
МЕХАНИЗМ
действия M.SsoII

M.SsoII: зачем нужно метилировать ДНК?
Зачем?
GO:0009307: (P)
Name: DNA restriction-modification system
Biological Process: Any process that protect an organism from invading foreign DNA by methylation of self DNA at specific sequences and nucleolytic cleavage of unmethylated foreign DNA.
Система рестрикции-модификации: любой процесс, защищающий организм от вторжения чужеродной ДНК посредством метилирования специфических последовательностей и гидролиза неметилированной чужеродной ДНК
Чужеродная ДНК – ДНК бактериофагов, плазмид и др.
Какие гены включает система РМ?
Rebase:
M.SsoII:
M.SsoII – ДНК метилтрансфераза
SsoII – эндонуклеаза рестрикции
SsoII - вносит двухцепочечный разрыв ДНК в неметилированных сайтах CCNGG
M.SsoII метилирует цитозин только в сайтах той же последовательности CCNGG; метилируя хозяйскую ДНК M.SsoII предотвращает фрагментацию собственного генома

Мы описали
БИОЛОГИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС
и
систему генов
его осуществляющих

M.Kpn2kI и M.SsoII
В каком организме?
Klebsiella pneumoniae
плазмида
Shigella sonnei, бактерия из семейства Enterobacteriaceae; патоген
плазмида
Сходство 100%; как объяснить?

M.SsoII
Какие еще функции известны?
Pfam:
два домена
GO:0045449: (P)
regulation of transcription; IEA:UniProtKB-KW.
регулятор транскрипции:
связывается с сайтами NNNNNN;
такие сайты расположены между генами M.SsoII и SsoII
репрессор гена M.SsoII и активатор SsoII
для чего?
для “размножения” плазмиды: проникновения в нового хозяина
механизм регуляции?
имеет N-концевой HTH домен, гомологичный известным доменам транскрипционных факторов
димеризуется при связывании с ДНК – еще одна функция: способность димеризации

M.SsoII
Где локализуется?
в цитоплазме хозяйской бактериальной клетки
а точнее? …..
Когда экспрессируется?
небольшая поддерживается постоянно; авторегуляция
при проникновении в нового хозяина увеличивается
ЛОКАЛИЗАЦИЯ и
ЭКСПРЕССИЯ

Итог: M.SsoII (и M.Kpn2kI)
Функции:
метилирование цитозина в сайтах CCNGG
связывание с ДНК в сайтах определенной последовательности
гомодимеризация при связывании с ДНК
Механизм:
узнавание последовательности – TRD домен
кофактор SAM
мотивы I - X
выворачивание основания
ход реакции
Биологический процесс:
защита от чужеродной ДНК
регуляция транскрипции системы РМ SsoII
Система рестрикции-модификации II типа; состоит из двух генов на трансмиссивной плазмиде
Локализация:
цитоплазма хозяйской клетки
Экспрессия
негативная авторегуляция

Базы данных
Uniprot
Pubmed
GO – gene onthology
EC - enzyme classification
Pfam, Interpro, а также Prosite, Panther, Prints, TIGERFam, SMART, Supfam – семейства белков/доменов
Brenda - The Comprehensive Enzyme Information System
Rebase – специализированная БД

Где искать описание функции
Краткое описание функций одного белка и ссылки на другие ресурсы см.
Краткое описание функций семейств белков и доменов
см. в и
Подробное описание функций генов и их продуктов см в энциклопедиях, таких как или
Подробное описание отдельных классов функций и соответствующих белков см. в специализированных БД, таких как ENZYME,Rebase , ...

Как нам узнать функцию интересующего нас и б.м. известного науке белка или гена?
+/+++ Читайте оригинальные статьи хороших авторов в хороших журналах!
Ищите в PubMed
-/++ Читайте аннотации записи Uniprot
Используйте SRS
-/+ Читайте аннотации записей Pfam и InterPro, содержащие описания семейств доменов, к которым принадлежат домены белка
-/+ Ищите ваш белок в специализированных БД (БД и энциклопедии, в которых подробно описаны функции генов и их продуктов : KEGG, BIOCYC, ENZYME, TC-DB, REACTOME….)
Ищите, предположительно, гомологичные белки самостоятельно. Используйте BLAST, psiBLAST, профили и паттерны

Задача II: найти белки с той же функцией
Та же молекулярная функция?
в аннотации записи Uniprot
нужные термины GO, помеченные F (molecular function)
нужные коды EC
Тот же механизм?
….. функция + гомология
Тот же биологический процесс?
нужные термины GO, помеченные P (biological process)
Та же система генов?
БД систем: KEGG, SEED, …
Та же локализация?
нужные термины GO, помеченные С (cellular component)

Что бывает
Верно ли, что у белки всегда есть “главная” функция?
нет; цитохром с: окислительное фосфорилирование
индукция апоптоза
Верно ли, что гомологичные белки имеют ту же основную функцию?
часто, но не всегда!
Верно ли, что белки с той же функцией гомологичны?
часто, но не всегда! (карбоангидраза)
Верно ли, что белки с одинаковой функцией участвуют в тех же биологических процессах?
не обязательно! (ДНК-метилтрансферазы)
Верно ли, что один и тот же биологический процесс реализуется сходными системами генов?
не обязательно! (лекарственная устойчивость)

Figure 1. Specific example of
convergent and divergent evolution.
Top, an example of convergent
evolution, showing structures
of two carbonic anhydrases with
the same enzymatic function (EC
number 4.2.1.1), but with different
folds. The Figure was drawn with
Molscript (Kraulis, 1991) from 1THJ
(left-handed beta helix) and 1DMX
(¯at beta sheet).
Hedi Hegyi and Mark Gerstein
J. Mol. Biol. (1999) 288, 147±164

Пробуем выделить классы белков по функции
Молекулярные машины – рибосома [&&&]
Ферменты - РНК-зависимая РНК полимераза [рабочие на производстве]
Регуляторные белки – регулируют биологические процессы, например, активность ферментов – TetR [бюрократия]
Хранение и транспорт (ионов, маленьких молекул) – гемоглобин [складские рабочие]
Транспорт через мембраны – TetA [таможенники]
Секреторные, взаимодействие с другими клетками – инсулин [командировочные?]
Структурные [атланты ☺]
Сигнальные [ ]
Рецепторы []
Мотор []

Проблема неоднозначности терминологии

Питер Брейгель старший
"Вавилонская башня" 1563
Музей истории искусств, Вена

Проект GO (Gene Ontology )
Цель: Создание унифицированной терминологии для аннотации генов
БД GO Включает три независимых словаря
Молекулярные функциии (molecular Function)
(Как? С чем?) Например, carbohydrate binding или ATPase activity
Биологические процессы (biological Process)
(Зачем?) Например, митоз или биосинтез пуринов
Клеточные компоненты (cellular Component)
(Где?) Например, ядро или холофермент РНК-полимераза II
В консорциум GO входит EBI (БД Uniprot, Interpro) и много других организаций
GOA – проект описания записей Uniprot терминами GO
94% записей Swissprot и 65% Trembl имеют хотя бы один термин GO

Запись GO называется “термин GO”
Термины имеют определение и перечень синонимов.
Термины в пределах одной онтологии (словаря) связаны отношениями ”is_a", “is_part_of”
Термины имеют стандартные идентификаторы:
GO:0000093 (пример)

tricarboxylic acid cycle
Accession: GO:0006099
Ontology: biological_process
Synonyms:
exact: citric acid cycle
exact: Krebs cycle
exact: TCA cycle
Definition: A nearly universal metabolic pathway in which the acetyl group of acetyl coenzyme A is effectively oxidized to two C02 and four pairs of electrons are transferred to coenzymes. The acetyl group combines with oxaloacetate to form citrate, which undergoes successive transformations to isocitrate, 2-oxoglutarate, succinyl-CoA, succinate, fumarate, malate, and oxaloacetate again, thus completing the cycle. In eukaryotes the tricarboxylic acid is confined to the mitochondria. See also glyoxylate cycle.

Directed acyclic graph DAG —ориентированный ациклический
граф
отношение "is_part_of":
"A is part of B" означает, что А — часть В, но
В не обязательно содержит А.
отношение "_is_a":
"A is B" означает, что
А — частный случай В;

The Gene Ontology database
Apoptotic protease activator

Аннотация GO записей Uniprot
Два принципа:
каждая аннотация должна ссылаться на источник:
литературная ссылка
другая база данных
компьютерное предсказание
…….
аннотация должна указывать на достоверность применимости термина GO к данному белку в источнике (kind of evidence)

Аннотация GO для MTS2_SHISO (UniProt)

Evidence Codes
IDA Inferred from Direct Assay
TAS Traceable Author Statement
IMP Inferred from Mutant Phenotype
IGI Inferred from Genetic Interaction
IPI Inferred from Physical Interaction
RCA Inferred from Reviewed Computational Analysis
ISS Inferred from Sequence Similarity
IEP Inferred from Expression Pattern
NAS Non-traceable Author Statement
IEA Inferred from Electronic Annotation
IC Inferred by Curator
ND No biological Data available

Предостережение:
GO не является номенклатурой генов или их продуктов (белков). Словари описывают биологические феномены (например, программируемую клеточную смерть), а не конкретные биологические объекты

Есть и другие онтологии, например,
exon,
promoter, binding_site, non_canonical_splice_site,
stop_codon. pseudogene

Резюме
Функциональная аннотация геномов — задача биоинформатики
Существуют энциклопедии, где можно узнать о функциях генов и их продуктов, например, BioCyc.
Полное описание функции — это ответы на вопросы "где?", "зачем?", "как?“, "с чем?“.
GO — перспективный подход к
разработке общего языка (решение проблема синонимов),
разработке формализованного описания функций, общего для всех организмов.