Газо-жидкостная хроматография

Газовая хроматография
- По мере движения по хроматографической колонке компоненты разделяемой пробы многократно распределяются между газом-носителем и неподвижной жидкой фазой, нанесенной на инертный материал, которым заполнена колонка.
- Принцип разделения - неодинаковое химическое сродство веществ к неподвижной фазе.
Предназначена для разделения смесей разнообразных веществ,
испаряющихся в пределах 40-350 оС без разложения.
Подвижная фаза - газ
Неподвижная фаза
Выход
веществ
Ввод пробы
(жидкость, нанесенная (привитая) на твердую подложку)

Область применения
• Летучие,термостабильные соединения либо летучие производные веществ
• лишь 5% известных органических соединений,
• но 70-80 % соединений, используемых человеком в сфере производства и быта.
Углеводороды, амины, серусодержащие соединения, пестициды, полихлорированные бензолы, эфирные масла, жирные кислоты, сложные эфиры, алкалоиды, лекарственные препараты, галогенсодержащие соединения, стероиды, ароматические соединения.

Достоинства газовой хроматографии
1) возможность идентификации и количественного определения индивидуальных компонентов сложных смесей, например нефтей;
5) возможность изучения различных свойств веществ и физико-химических взаимодействий в газах, жидкостях и на поверхности твердых тел.
2) высокая четкость и быстрота разделения, обусловленные низкой вязкостью подвижной фазы - газа;
3) микропробы и автоматическая запись результатов, благодаря высокой чувствительности и малой инерционности приборов;
4) возможность анализа широкого круга объектов — от легких газов до высокомолекулярных органических соединений и некоторых металлов;

Недостатки газовой хроматографии
1) Ограничение лишь парообразными пробами;
Но!
Газовая хроматография сейчас – одна из самых распространенных аналитических техник;
более 50 тыс. действующих в мире приборов.
2) Вещества должны иметь точку кипения ниже 350 оС; не быть термолабильными;
3) Нередко необходима интенсивная пробоподготовка;
4) Для идентификации пиков часто необходимы сложные методы – масс спектрометрия;

Фирмы, выпускающие газовые хроматографы:
~ 130 производителей в мире:
Thermo Fisher Scientific, Agilent, Perkin-Elmer, Shimadzu,
Brucker, Chromtech, Dionex
3 производителя в России и СНГ: Хроматек, Аналитприбор, ЦветАналитик

Принципиальная схема газового хроматографа
Термостатируемые элементы заключены в пунктирный контур.
Баллон высокого давления с газом-носителем
Модуль контроля потока
Устройство
для ввода пробы
Термостат
Детектор
хроматографическая
колонка
Система анализа
данных

Газ-носитель переносит разделяемые компоненты по колонке, не взаимодействуя ни с разделяемыми веществами, ни с неподвижной фазой.
Вспомогательные газы: кислород, водород, воздух, азот, необходимые для работы детектора.
Газ-носитель: гелий, азот, водород, аргон
Система подготовки газов служит для установки, стабилизации и очистки потоков газа-носителя и дополнительных газов. Включает блок регулировки расходов газов.

В России принята цветовая маркировка баллонов, содержащих различные газы.
Газовый реду́ктор — устройство для понижения давления газа на выходе, находящегося в какой-либо ёмкости (баллоне или газопроводе), до рабочего и для автоматического поддержания этого давления постоянным, независимо от изменения давления газа в емкости.

Система дозирования позволяет вводить в поток газа-носителя определенное количество анализируемой смеси в газообразном или жидком состоянии. Представляет собой устройство с самоуплотняющейся резиновой мембраной или кран-дозатор. Ввод пробы осуществляется с помощью микрошприца или дозирующей петли.
Устройство ввода пробы термостатировано при температуре, равной температуре колонки или выше на 20 − 30°С.
септа
Инжектор капиллярный
с делением/без деления
потока
Микро-
шприц
Регулятор потока газа
Обдув
септы
Капиллярная
колонка
Клапан деления
потока
Поток
на сброс
лайнер
аэрозоль
пробы

С потоком газа-носителя проба из инжектора переносится в колонку, которая помещена в термостат.
Материалом для изготовления колонок служат стекло, нержавеющая сталь, медь, иногда фторопласт. В последнее время наибольшее распространение получили капиллярные колонки, изготовленные из кварца с полиамидными пленками.

Разделение на набивной и капиллярной колонках одной и той же смеси

Типы капиллярных колонок
− открытые с пленочной НЖФ (0.1-0.8 мкм) - wall-coated open tubular columns (WCOT) - классические;
− открытые с пористым слоем (адсорбенты Al2O3/KCl, молекулярные сита или полимеры) – porous layer open tubular columns (PLOT) - для газов;
− открытые с твердым носителем, «пришитым» к стенкам, на который нанесена НЖФ - support-coated open tubular columns (SCOT).
WCOT
PLOT

− органическая до 240°С;
− кремнийорганическая до 360°С.
Классификация неподвижных фаз по максимально допустимой рабочей температуре:
Верхний предел температуры обычно определяется величиной испарения, при медленном уносе неподвижной жидкой фазы потоком газа-носителя.

Неподвижные жидкие фазы
- 60 до 360 оС
- 60 до 320 оС
- 20 до 260 оС
Метил-полисилоксаны
Фенил, циано, пропил-полисилоксаны и т.п.
Полиэтиленгликоли, фталаты
п о л я р н о с т ь

Принцип «Подобное растворяется в подобном;
а разделяется противоположным»

Факторы, влияющие на эффективность разделения
Диаметр колонки
малые внутренние диаметры, например 0,25 мм, предпочтительнее
Длина колонки
длину следует увеличивать в 4 раза, чтобы по-
лучить в 2 раза большую степень разделения
Газ-носитель
Легкие водород, гелий лучше применять для колонок с малым содержанием НЖФ, которые работают с высокими скоростями потока для быстрых аналитических разделений.
Тяжелые газы-носители (азот, аргон) наиболее пригодны для колонок с высоким содержанием НЖФ, в полупрепаративном режиме.
Зависит от конструкции колонки, неподвижной жидкой фазы, газа-носителя, температуры. На практике линейная скорость составляет 1 - 24 см3/сек.
Скорость газа-носителя

смесь н-алканов
t, min
t, min
t, min
Факторы, влияющие на эффективность разделения
Оптимальная температура - компромисс между разделением, которое ухудшается, и скоростью анализа, которая увеличивается с возрастанием температуры.
Температура

Режим работы хроматографа
Программирование температуры: вещества проходят по колонке при температуре, оптимальной для их разделения, если соответствующим образом выбраны начальная температура и скорость нагрева. В результате продолжительность анализа значительно снижается, достигается хорошее разрешение, а высота последних пиков возрастает.
Факторы, влияющие на эффективность разделения

Терморежим хроматографа
изотермальный
Зоны раздельного температурного контроля:
1) инжектор, 2) термостат, 3) детекторы
Температурный контроль термостата
градиентный

Система детектирования измеряет изменения физико-химических свойств выходящей из колонки смеси (компонент + газ-носитель) и преобразует в электрический сигнал. Величина сигнала зависит как от природы компонента, так и от содержания его в анализируемой смеси.
Критерии оценки детекторов:
− чувствительность, минимально детектируемая концентрация;
− уровень шума, дрейфа нулевой линии;
− диапазон линейности;
− эффективный объем и время отклика (быстродействие);
− селективность.

Схема пламенно-ионизационного детектора
CH• + O• → CHO+ + e−
Принадлежит к ионизационным детекторам, принцип работы которых основан на изменении ионного тока, вызванного введением в детектор анализируемого вещества. Ионный ток возникает под действием источника ионизации и электрического поля между электродами детектора.
CHO+ + H2O → H3O+ + CO

Радиоактивный источник испускает β-частицы, ионизирующие молекулы газа-носителя, с образованием ионов и тепловых электронов, которые формируют электрический ток в камере детектора. Принцип действия этого детектора основан на уменьшении проводимости, вызываемом захватом электронов веществом, содержащим атомы с высокой электроотрицательностью.
Схема детектора электронного захвата
N2 → N 2+ + e−
АВ + e− → АВ−
АВ− + N2+ → АВ + N2

Наиболее информативный детектор. Принцип действия: при ионизации молекулы в вакууме образуется группа характеристических ионов. Число образующихся ионов пропорционально количеству поступающего вещества, регистрируется изменение полного ионного тока. Одновременно с записью хроматограммы в любой ее точке, может быть зарегистрирован масс-спектр (зависимость интенсивности ионного тока от массы иона).
Масс-спектрометрический детектор
квадрупольный анализатор
Пример хроматограммы по всем ионам.
магнитно-секторный анализатор

Как работает масс-спектрометрический детектор?
Источник ионов:
химический,
электронного удара,
электроспрей,
малди
Масс-анализатор:
Магнитно-секторный,
квадрупольный,
времяпролетный,
ловушки
Детектор

Пример масс-спектра фенолсодержащего вещества

Хроматомасс спектрометр Agilent 5975C GC

Подготовка биологических образцов для хроматографических анализов
Биологические пробы часто не подходят для прямого анализа газовой хроматографией !
Низкие концентрации определяемых веществ;
Многокомпонентная матрица, мешающая разделению;
Матрица вредна или несовместима с хроматографической колонкой;
Интересующие вещества нелетучи либо разрушаются при высоких температурах.

Методические приемы подготовки биологических образцов
Гомогенизация (измельчение)
Добавление реагентов
Установка рН
Смешивание (встряхивание)
Нагревание (охлаждение)
Осаждение
Жидкофазная и твердофазная экстракция
Фильтрование
Центрифугирование
Выпаривание
Дериватизация
Очистка на колонках или в тонком слое

Для разделения и выделения групп веществ из сложных матриц применяется колоночная и (или) тонкослойная хроматография. Нужная группа элюируется, т.е. смывается с силикагеля, и далее используется для более подробного анализа газовой хроматографией.
колонка
смесь
веществ
группы
веществ

Реакционная газовая хроматография
Это направленные химические превращения нелетучих соединений в летучие, а также неустойчивых в устойчивые для дальнейшего ГХ анализа.
Один из способов: получение сложных эфиров
На практике используют:
диазометановый метод, RCOOH + CH2N2 → RCOOCH3 + N2,
метанольный метод, RCOOH + CH3OH → RCOOCH3

Хотя теория дает солидную основу для хроматографических процессов, когда дело доходит до практической работы, хроматография все еще является искусством. Она требует умения и опыта для обращения с системой колонок и манипулирования с пробой, скоростью потока газа-носителя и температурой, часто на основании метода проб и ошибок ☺

Исследуемые смеси:
метиловые эфиры жирных кислот
Насыщенные и мононенасыщенные ЖК

Холин -полярный фосфолипид
Отщепление
при
метанолизе
Жирные кислоты – составляющие сложных липидов,
в том числе полярных липидов

Классификация жирных кислот: длина и форма углеродной цепи;
степень ненасыщенности;
присутствие полярных групп.
1. Насыщенные кислоты
лауриновая 12:0
кокосовое масло >50%
миристиновая 14:0
пальмитиновая 16:0
пальмовое масло, животные жиры - 50%
стеариновая 18:0
бараний жир >30%
олеиновая 18:1ω9
оливковое и салатное подсолнечное масло - 80%
2. Моноеновые кислоты
СООН
Насыщенные
разветвленные кислоты
изопентадекановая i15:0
мембраны бактерий > 25%